基于線粒體DNA控制區序列的重慶巖原鯉人工養殖群體遺傳多樣性分析

岳華梅 阮 瑞 曹 宏 周 莉 蔣 偉 李 雙 李創舉

(1. 中國水產科學研究院長江水產研究所, 農業部淡水生物多樣性保護重點實驗室, 武漢 430223; 2. 中國科學院水生生物研究所, 武漢 430072; 3. 重慶市水產科學研究所, 重慶 400020)

巖原鯉(Procypris rabaudi), 隸屬鯉形目, 鯉科,鯉亞科, 原鯉屬, 是我國特有的重要經濟魚類。其主要分布于長江上游干流、支流及金沙江中上游,是一種棲居于巖石縫間的底層魚, 以四川境內嘉陵江和岷江分布較多[1]。巖原鯉成魚為雜食偏肉食性魚類, 主要攝食底棲動物, 如淡水殼菜、蜆、小螺等軟體動物和搖蚊幼蟲、蜉蝣目和毛翅目幼蟲等[2]。由于過度捕撈、環境污染及長江上游大型水壩建立對其棲息環境的破壞, 巖原鯉野生資源銳減, 瀕臨滅絕, 現已被列入《中國瀕危動物紅皮書》[3,4]。目前其資源養護手段主要為人工繁殖個體增殖放流。然而, 在巖原鯉人工繁殖過程中, 繁育場面臨著有效繁殖群體過小、近親交配和逆向選擇等問題。因此在進行巖原鯉人工育種時有必要對后備親魚的遺傳背景進行分析, 以抑制養殖群體的種質退化和防止因近交衰退而造成后代成活率降低和生長速度減慢等。

線粒體DNA(mtDNA)呈母系遺傳, 具有較高的突變性, 突變固定后形成的多態性位點反映出群體遺傳特性、種群分化和種屬關系等特點[5,6]。線粒體控制區(Control region, 又稱D-loop)是線粒體上的一段非編碼區, 位于mtDNA的tRNA-Pro 和tRNAPhe之間, 因缺乏編碼選擇壓力而比其他線粒體基因的進化速率更快, 其堿基替換率比mtDNA的其他區域高5—10倍, 是線粒體基因組中最具多態性的片段, 已成為探討種群內部遺傳多樣性和分子系統地理學的良好材料[7—9]。本研究旨在利用D-loop部分序列研究重慶地區巖原鯉人工養殖群體的遺傳多樣性, 以期為人工繁殖中親魚的選擇, 避免近交退化及提高用于增殖放流人工繁殖群體的遺傳多樣性等提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

實驗所用175尾巖原鯉 [全長(36.18±3.14) cm,體重(597.97±166.40) g] 樣本采自重慶市農業投資集團養殖基地, 其中117尾個體采自長壽養殖基地,58尾樣本采自涪陵養殖基地。分別取鰭條樣本, 采用95%乙醇固定保存備用。

1.2 DNA提取、擴增和測序

根據NCBI所下載的巖原鯉D-loop序列信息, 采用Primer premier 5.0軟件進行特異引物設計, 上游引物mtD-F: 5′-GGAAAACCACCCCTTATGGTA-3′; 下游引物mtD-R: 5′-TTACACGTTCTTGAG TCCTCC-3′。采用高鹽法提取基因組DNA后, 分別利用上下游引物對所有樣品進行PCR擴增, 反應體系50 μL, 包括: 2×PremixTaqTM(TaKaRa), 25 μL;10 μmol/L上下游引物, 各1 μL; DNA模板, 1 μL; 滅菌超純水22 μL。PCR擴增在Bio-Rad C1000型PCR儀上進行, 反應程序: 95℃預變性3min后, 95℃變性30s, 55℃退火35s, 72℃延伸50s, 運行32個循環, 最后72℃下延伸5min。擴增后進行PCR產物雙向測序(武漢奧科生物工程有限公司)。

1.3 數據分析

為確保序列的可靠性, 所有測得的DNA序列采用BioEdit[10]軟件進行拼接并與測序峰圖進行校對,通過BLAST (http://www.ncbi.nlm.gov/BLAST/) 檢索確定為目的片段。另外, 從NCBI網站下載獲得201條巖原鯉不同單倍型的D-loop部分核酸序列, 并根據相關文獻[11—13]進行樣本來源及序列核對。所下載序列的GenBank登錄號分別為EU683674.1—EU683676.1和HQ199633.1—HQ199832.1。其中用于遺傳多樣性比較分析的巖原鯉野生樣本來源于長江干流中的萬州江段(WZ)、合江江段(HJ)、木洞江段(MD)及長江支流中的蒼溪江段(CX)、唐河江段(TH)、武隆江段(WL)、通江江段(TJ)、習水河江段(XS)。另外還選取了巖原鯉北碚人工養殖群體(BB)同樣用于遺傳多樣性比較分析。序列比對采用MAFFT軟件進行, 并使用Seaview軟件[14]進行人工校正。利用DnaSP v5.0軟件[15]統計樣品的單倍型數、單倍型多樣性和核苷酸多樣性。隨后采用Network 5.0軟件[16]構建單倍型網絡圖, 用以檢測單倍型之間的進化關系。應用Mega 7.0軟件[17]基于Kimura 2-paramter模型計算單倍型之間的遺傳距離, 并利用MrModelTest軟件[18]篩選核苷酸替換模型, MrBayes軟件[19]進行進化樹構建。

2 結果

2.1 序列特征

通過測序, 共擴增獲得巖原鯉D-loop 768—769 bp的DNA序列, 序列長度差異來源于5個個體序列中的一個堿基T缺失。對其中692 bp的區域進行后續序列分析, 發現其堿基T、C、A和G的平均含量分別為35.22%、17.86%、33.83%和17.09%, 堿基G的含量明顯低于其他3種堿基, 表現出典型的反G偏倚。并且A+T的平均含量為69.05%, 而G+C的平均含量為34.95%。進一步的序列分析共檢測得到15個變異位點, 占總分析位點的2.17%, 其中13個變異位點為序列轉換(6個A和G轉換, 7個T和C轉換),1個位點為A和T序列顛換, 1個位點為堿基T缺失(圖1)。175條序列共定義11種單倍型, 其中Hap1為主要單倍型, 所含樣本為134個, 占總樣本量的76.57%。單倍型序列已上傳至NCBI, GenBank登錄號為MT119068—MT119078。

圖1 巖原鯉不同單倍型變異位點分布Fig. 1 The positions of variable sites in different haplotypes of P.rabaudi

2.2 遺傳距離分析

采用Network 5.0軟件構建單倍型網絡連接圖,結果顯示單倍型Hap10演化速率較快, 與單倍型Hap6遺傳距離最遠(圖2A)。單倍型Hap1與Hap2遺傳距離最近。進一步的系統發育樹結果顯示,11個單倍型共分為7支, 其中單倍型Hap7、Hap8、Hap9和Hap10聚為一支, 然后再與Hap11聚為一支(圖2B)。

圖2 基于D-loop序列構建的巖原鯉不同單倍型簡約網絡圖(A)及系統發育樹(B)Fig. 2 The statistical parsimony network (A) and phylogenetic tree (B) constructed based on the D-loop sequences of P. rabaudi

2.3 遺傳多樣性分析

將本研究所得175條巖原鯉D-loop部分序列與宋君[11,12]、朱成科等[13]研究中201條序列進行遺傳多樣性比較分析。結果顯示, 所有序列分析得到的單倍型個數為49個, 單倍型個數最多及最少的群體分別為木洞江段野生群體(18個)及北碚人工養殖群體(2個; 表1)。另外, 本研究中的重慶人工養殖群體中有兩個單倍型(Hap10和Hap11)為群體內獨享單倍型, 其他 9個單倍型為群體間共享單倍型。遺傳多樣性最為豐富的為萬州江段野生群體, 其核苷酸多樣性及單倍型多樣性分別為0.0147±0.0033和0.9590±0.0310, 其次為木洞江段野生群體。本研究中長壽和涪陵地區巖原鯉人工養殖群體核苷酸多樣性分別0.0013±0.0003和0.0013±0.0004, 單倍型多樣性分別為0.4100±0.0550和0.3970±0.0820。其遺傳多樣性低于所有野生群體, 但略高于北碚人工養殖群體(表1)。

3 討論

3.1 巖原鯉種群遺傳多樣性

遺傳多樣性是衡量物種進化潛力的重要指標,遺傳多樣性越高, 表明物種對環境改變的適應能力更強, 進化潛力越大[20]。群體遺傳多樣性每損失10%, 即會對其繁殖能力、存活率和生長等重要生理性狀產生極大的負面影響[21]。核苷酸多樣性代表了每個群體內各個單倍型兩兩配對差異的平均值, 是一個群體的遺傳多樣性指標, 當核苷酸多樣性指數在0.0010—0.0047時, 其群體的遺傳多樣性較低[22]。在本研究中, 重慶巖原鯉人工養殖群體的核苷酸多樣性指數為0.0013, 顯示其遺傳多樣性較低。而8個巖原鯉野生群體中, 有5個野生群體的遺傳多樣性指數大于0.0047, 顯示出較為豐富的遺傳多樣性。另外, 重慶巖原鯉人工養殖群體的單倍型多樣性指數也顯著低于野生群體(表1)。根據群體單倍型多樣性和核苷酸多樣性之間的關系可將群體的擴張事件分為4 種類型[23]: ①低單倍型多樣性和低核苷酸多樣性(Hd<0.5,π<0.5%), ②高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性; ③低單倍型多樣性和高核苷酸多樣性; ④高單倍型多樣性和高核苷酸多樣性。重慶巖原鯉人工養殖群體遺傳多樣性類型應屬于第①中類型, 此種類型表明群體最近發生了瓶頸效應或由單一、少數系群發生了奠基者效應。

表1 基于D-loop序列的巖原鯉遺傳多樣性參數Tab. 1 Parameters of the genetic diversity of P. rabaudi based on the D-loop sequences

3.2 巖原鯉的遺傳結構分析

巖原鯉重慶人工養殖群體D-loop序列分析顯示其堿基G的含量明顯低于其他三種堿基, 并且平均(A+T)含量明顯高于(C+G)含量, 該結果與其他魚類中的研究結果相符[24—27]。遺傳距離的估計在分析群體間遺傳關系、預測雜種優勢和指導親本選配等方面具有重要作用[28]。在本研究中, 重慶巖原鯉養殖群體單倍型Hap1所含樣本數量最多, 并且與其他單倍型之間的遺傳距離相對較近, 而單倍型Hap10與其他單倍型的遺傳距離相對較遠。在進行巖原鯉人工繁育時, 應盡量選擇遺傳距離較遠的個體進行配對, 并定期補充不同地區不同群體的個體作為后備親魚, 保持其人工繁殖群體的遺傳多樣性,避免近親繁殖和瓶頸效應。本研究所得到的巖原鯉種群遺傳結構特征對于其人工繁育(引種、人工繁殖、雜交等)及遺傳多樣性的監測具有重要意義。