南板藍根不同提取物中靛藍、靛玉紅和色胺酮含量及其抑菌活性的研究※

●孫 媛 田秀秀 丁江生

南板藍根來源于爵床科植物馬藍[Baphicacanthuscusia(Nees)Bremek.]的干燥根莖和根，味苦，性寒，具有清熱解毒、涼血消斑等功效，可用于瘟疫時毒、發(fā)熱咽痛、溫毒發(fā)斑等，已被廣泛應用于各種制劑中?，F代研究證明，南板藍根含有多種化學成分，如（R,S）-告衣春、腺苷、靛藍、靛玉紅、多糖、色胺酮等；具有良好的抗病毒、抗菌、抗腫瘤、抗炎等方面的藥理活性，包括滅活甲型流感病毒，延長流感病毒FM1株感染小鼠的平均存活天數，抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和皮膚真菌，治療慢性粒細胞性白血病，抑制一般癌腫細胞生長和擴散程度等。其中抗病毒、抗腫瘤等方面研究報道較多，但抗菌方面的許多作用機理仍待考察。本中心根據前期研究結果，擬將其組方開發(fā)為治療痤瘡的外用產品。

然而，南板藍根作為常用中藥，雖大眾接受度高，但在不同產地、野生和栽培品種、不同溶劑提取物之間質量差異明顯。同時，《中國藥典》南板藍根項下，未見對其質量指標成分的定量控制。為進一步研究南板藍根成分與抑菌活性的相關性，采用高效液相色譜法，以南板藍根主要成分靛藍、靛玉紅和色胺酮為指標，對南板藍根水、醇等不同溶劑提取物的指標成分含量情況和對丙酸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌的體外抑菌情況進行考察，為該藥規(guī)范質量，優(yōu)化提取溶劑，拓寬使用范圍，開發(fā)外用抑菌產品研究提供依據[1-10]。

1 材料

1.1 儀器Agilent1100 高效液相色譜儀（美國安捷倫）；KQ5200DE 數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BSA224S-CW 電子天平[賽多利斯科學儀器（化學）有限公司]；JJ-2000型電子天平（江蘇常熟市雙杰測試儀器廠）；BCD-208K/A 海爾冰箱（青島海爾股份有限公司）；DZTW調溫電熱套（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；DZKW-S-6電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療）；BPZ-6210LC 型真空干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；THZ-D型臺式恒溫振蕩器（江蘇太倉實驗設備廠）；Thermo Multiskan GO 全波長酶標儀（美國BIO-RAD公司）；GNP-9270隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設備有限公司）。

1.2 試藥靛藍對照品（北京世紀奧科，批號170404，編號482-89-3，HPLC≥98%）；靛玉紅對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110717-200204）；色胺酮對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號M10O8L45439，編號S31557，HPLC≥98%）；南板藍根（昆明市官渡區(qū)千草源中藥材經營部，批號20170527）；美羅培南[佳友制藥（蘇州）有限公司，批號20161204]；乙腈（色譜純，默克股份）；水為高純水；N,N-二甲基甲酰胺、95%乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷均為分析醇；酵母提取物（Oxoid Ltd,Basingstoke,Hampshire,England，批號LP0021）；胰蛋白胨（Oxoid Ltd,Basingstoke,Hampshire,England，批號LP0042）；氯化鈉（上海試四赫維化工有限公司，批號 1306101）；MUELLER-HINTON（Oxoid Ltd,Basingstoke,Hampshire,England，批號CM0405）；沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(青島高科園海博生物技術有限公司，產品批號HB0253-7)；瓊脂粉（北京奧博星生物技術有限責任公司，批號20091102）。

1.3 供試菌種丙酸桿菌Propionibacterium acnesATCC11827；金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC29213；白色念珠菌Canidia albicans ATCC10231 均購自美國特種物品貯藏中心（ATCC），接種、傳代后于4 ℃保存。

2 方法與結果

2.1 南板藍根不同溶劑提取物的制備稱取相同重量的南板藍根藥材，分別加入10倍量的水、甲醇、50%乙醇、80%乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮溶劑，分別加熱回流提取2次，每次2 h，過濾提取液，60 ℃真空濃縮，干燥，即得南板藍根不同溶劑提取物。密封陰涼保存，備用。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 ECOSIL 120-5-C18 色譜柱(5.0 μm，4.6×250 mm，廣州綠百草)，乙腈∶水=70∶30 為流動相，柱溫25 ℃，流速1.0 mL·min-1，進樣量10 μL，檢測波長289 nm。

2.2.2 對照品溶液制備 分別精密稱取靛藍、靛玉紅和色胺酮對照品2.060 mg、2.520 mg、10.112 mg，置50 mL 容量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺溶解并定容至刻度，超聲（150 W，40 kHz）5 min，搖勻，即得。

2.2.3 樣品溶液制備 分別精密稱取2.1項下的南板藍根不同溶劑提取物0.5 g，置于50 mL容量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺40 mL，超聲20 min，放冷，N,N-二甲基甲酰胺定容至刻度，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.4 專屬性試驗 取2.2.2 項下的對照品溶液，取N,N-二甲基甲酰胺為空白溶液，按2.2.3 項下的制備方法，取南板藍根80%乙醇提取物，制備樣品溶液；并分別加入靛藍、靛玉紅和色胺酮對照品，制備對照及樣品混合溶液。按上述色譜條件進行測定，記錄色譜圖。此條件下靛藍、靛玉紅和色胺酮分離良好，無干擾。見圖1。

圖1 專屬性實驗HPLC圖

2.2.5 線性關系考察 分別精密量取2.2.2 項下靛藍、靛玉紅和色胺酮混合對照品溶液1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL 置于10 mL 容量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺定容，搖勻，分別得到靛藍濃度為：4.12，8.24，16.48，24.72，32.96，41.20 μg.mL-1；靛玉紅濃度為：5.04，10.08，20.16，30.24，40.32，50.40 μg.mL-1；色胺酮濃度為：20.22，40.45，80.90，121.34，161.79，202.24 μg.mL-1的對照品溶液，0.45 μm 濾膜過濾，按2.2.1 項下色譜條件測定，記錄峰面積。以對照溶液濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標(Y)，繪制標準曲線,結果見表1。

表1 靛藍、靛玉紅和色胺酮線性關系（n=6）

2.2.6 精密度試驗 精密量取2.2.5 項下混合對照品溶液，按上述色譜條件，連續(xù)進樣6 次，記錄峰面積，并計算RSD值。結果表明，靛藍、靛玉紅和色胺酮的日內精密度RSD 值分別為1.41%（n=6）、0.77%（n=6）、1.62%（n=6），表明日內精密度良好。連續(xù)進樣3天，記錄峰面積，并計算RSD 值。結果表明，靛藍、靛玉紅和色胺酮的日間精密度RSD值分別為1.46%（n=6）、0.81%（n=6）、0.71%（n=6），表明日間精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一份樣品溶液，分別于0，2，4，6，10，12 h按上述色譜條件測定，記錄峰面積，并計算RSD 值。結果表明，靛藍、靛玉紅和色胺酮的穩(wěn)定性RSD 值分別為2.90%（n=6）、2.24%（n=6）、1.39%（n=6），表明樣品溶液在12 h內穩(wěn)定。

2.2.8 重復性試驗 精密稱取0.5 g 南板藍根80%乙醇提取物6份，按2.2.3項下要求，配制樣品溶液，按上述色譜條件測定，記錄峰面積，并計算RSD 值。結果表明，靛藍、靛玉紅和色胺酮的重復性RSD 值分別為2.36%（n=6）、1.29%（n=6）、1.39%（n=6），表明重復性良好。

2.2.9 回收率試驗 精密稱取已知含量的南板藍根提取物，分別按含量的50%，100%，150%精密加入靛藍、靛玉紅和色胺酮對照品，按2.2.3 項制備樣品溶液，每個濃度平行制備3份，按上述色譜條件測定，記錄峰面積，計算回收率，結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果（n=9）

2.2.10 得率測定 分別精密稱取0.5g 南板藍根不同溶劑提取物，按2.2.3項制備樣品溶液，并根據線性范圍適當稀釋，每個樣品平行制備2 份，按上述色譜條件測定，記錄峰面積，計算含量，并結合提取率，計算各提取物在生藥材中對應靛藍、靛玉紅和色胺酮的得率。結果提示，南板藍根乙酸乙酯提取物中靛藍和靛玉紅對應的生藥材得率最高，分別為0.6702 mg/g和0.2353 mg/g；80%乙醇提取物中色胺酮對應的生藥材得率最高，為0.1017 mg/g。見表3。

表3 南板藍根不同溶劑提取物得率測定結果

2.3 體外抑菌活性測定

2.3.1 菌種培養(yǎng) 從菌落平板上挑選丙酸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌分別接種于已滅菌的MH、LB、沙氏液體培養(yǎng)基中，37 ℃，100 rpm/min振蕩培養(yǎng)24 h?；罨?，按1∶100 接種，以37 ℃、200 rpm/min振蕩培養(yǎng)12 h。其中丙酸桿菌、白色念珠菌全程厭氧。

2.3.2 最小抑菌濃度（MIC）測定 96孔細胞培養(yǎng)板經紫外線照射30 min后，采用連續(xù)二倍微孔稀釋法，以美羅培羅為陽性對照，同時設立受試樣品（其中極性偏大的提取物，如水、甲醇、50%乙醇、80%乙醇提取物樣品濃度為15.00 mg/mL；極性偏小的提取物，如乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮提取物樣品濃度為6.20 mg/mL）、菌液對照、培養(yǎng)基對照和溶媒對照。調整菌濃度至含1×106CFU/mL 活菌，每排第一孔內加入190 μL 菌液，第二至第十二孔內均加入100 μL 菌液。分別將受試樣品10 μL加入第一孔中，混勻后吸取100 μL 菌液加入第二孔中，繼續(xù)混勻后再吸取100 μL菌液加入第三孔。依次操作，最后，第十二孔內溶液混勻后吸取100 μL 棄去。37 ℃，培養(yǎng)24 h，其中丙酸桿菌、白色念珠菌全程厭氧培養(yǎng)。未見混濁的最低樣品濃度即為最小抑菌濃度。結果表明，南板藍根乙酸乙酯提取物對丙酸桿菌和金黃色葡萄球菌有明顯抑制作用，MIC分別為0.155 mg/mL和0.310 mg/mL；80%乙醇提取物對白色念珠菌有抑制作用，MIC為0.750 mg/mL。見表4。

表4 南板藍根不同溶劑提取物抑菌作用結果

3 討論

南板藍根作為歷史悠久的中藥，分布及使用范圍廣，化學成分復雜。我中心擬將南板藍根與重樓等不同抑菌機理的中藥組合，開發(fā)用于痤瘡治療的外用制劑。因此，本研究選用丙酸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌為菌種進行評價，并優(yōu)先探索南板藍根成分報道較集中的靛藍、靛玉紅和色胺酮在不同溶劑提取物中的生藥材得率及活性情況。本研究結果表明，南板藍根以乙酸乙酯為提取溶劑效果更佳。

實驗結果表明，南板藍根乙酸乙酯提取物對丙酸桿菌、金黃色葡萄球菌均有明顯抑制作用，其中對丙酸桿菌作用略強。同時發(fā)現，南板藍根乙酸乙酯提取物中靛藍、靛玉紅對應的生藥材得率也高于其它提取物，分別為0.6702 mg/g 和0.2353 mg/g。此外，南板藍根80%乙醇提取物對白色念珠菌有抑制作用，其余提取物均未出現，對比得率，發(fā)現其色胺酮對應的生藥材得率最高，為0.1017 mg/g。因此，推測南板藍根的抑菌活性與靛藍、靛玉紅和色胺酮有一定相關性。

研究發(fā)現，不同來源的南板藍根采用同一溶劑提取，提取率和指標成分含量差異明顯。因此，評價南板藍根不同溶劑提取物中靛藍、靛玉紅和色胺酮的含量，以最終可從生藥材中獲得的得率為指標，更具實用和指導意義。