加減蒼附導痰湯治療多囊卵巢綜合征的網絡藥理學機制

龍泳伶， 楊芳， 張瑤， 曾蕾， 盧如玲， 余璟瑋， 張如月

（1.廣州中醫藥大學中藥學院，廣東廣州 510006；2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東廣州 510405；3.廣州市番禺區何賢紀念醫院，廣東廣州 510000）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是一種多系統疾病，是世界范圍內女性不孕的主要原因，其發病率為5%~10%，占不排卵性不孕的50%~70%[1]。多囊卵巢綜合征患者常伴隨高雄激素血癥、高胰島素血癥、胰島素抵抗、雌激素升高、黃體生成素和卵泡刺激素比例失衡、不孕、肥胖以及其他健康問題，且其治療現狀非常不理想，嚴重影響婦女的身心健康。多囊卵巢綜合征的防治目前已成為亟待解決的公共衛生問題之一[2]。

多囊卵巢綜合征屬中醫學“月經后期”“閉經”“不孕”等病證的范疇。該病的中醫病因病機主要與腎虛、脾虛、血瘀、痰濕有關。胰島素抵抗發生的主要原因與內臟脂肪堆積有關，應屬“痰濕”范疇[3]。廣州中醫藥大學第一附屬醫院婦科張玉珍教授總結對多囊卵巢綜合征患者的臨床診治經驗，認為多囊卵巢綜合征多屬痰濕內阻型，治療當以健脾化痰、補腎調經為主要治法，擬定加減蒼附導痰湯治療多囊卵巢綜合征效果顯著[4]。蒼附導痰湯是化痰燥濕的經方，但用于治療痰濕證月經病時方中缺乏行血調經之品，張玉珍教授在此基礎上以補腎健脾化痰、活血調經立法，組方加減蒼附導痰湯，該方由蒼術、香附、法半夏、陳皮、茯苓、黃芪、石菖蒲、皂角刺、當歸、丹參、淫羊藿等藥味組成[5]。多項臨床研究結果表明，加減蒼附導痰湯可減輕多囊卵巢綜合征患者的肥胖、超重情況，改善胰島素抵抗狀態，具有調節糖代謝、脂代謝的作用，并可調節性激素水平，改善受孕情況，提高妊娠率[6-8]。相關動物實驗結果表明，加減蒼附導痰湯能夠明顯改善多囊卵巢綜合征大鼠體質量、胰島素抵抗及高雄激素狀態，可上調多囊卵巢綜合征大鼠卵巢組織及骨骼肌組織胰島素信號通路磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的活性，使蛋白PI3K/AKT相對表達量升高，對卵巢顆粒細胞也具有調節內分泌、抑制凋亡等作用[9]。但加減蒼附導痰湯治療多囊卵巢綜合征的作用機制仍不甚清楚。

網絡藥理學是基于系統生物學和生物信息學理論，建立在高通量組學數據分析、計算機虛擬計算及網絡數據庫檢索基礎上實現新藥設計和藥物作用機制挖掘的學科，可揭示“藥物-靶點-疾病”相互作用關系網絡，闡釋疾病的發生發展過程，從改善或恢復生物網絡平衡的整體觀角度認識藥物與機體的相互作用并指導新藥開發。因此，本研究擬通過網絡藥理學方法，分析加減蒼附導痰湯治療多囊卵巢綜合征的作用機制，以期為臨床應用加減蒼附導痰湯治療多囊卵巢綜合征疾病提供更多的研究基礎，現將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 加減蒼附導痰湯潛在活性成分的篩選及對應靶蛋白的查找中藥系統藥理學分析平臺（TCMSP）（http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）是一個集中藥、化學制劑、靶標和藥物靶標網絡為一體的數據庫[10]。以11味組成中藥蒼術、香附、法半夏、陳皮、茯苓、黃芪、石菖蒲、皂角刺、當歸、丹參、淫羊藿為關鍵詞，檢索加減蒼附導痰湯的化學成分。由于中藥的成分復雜多樣，且考慮到人體與藥物之間的相互作用，故需要對中藥成分進行條件篩選。類藥性（drug-likeness，DL）是被廣泛應用于評價藥物先導化合物能否成藥的條件。因此，從數據庫中檢索化學成分的口服生物利用度（oral bioavailability，OB）和類藥性，選取同時滿足OB≥30%、DL≥0.18并去除無明確作用靶點的化學成分作為活性成分，進一步篩選加減蒼附導痰湯中11味中藥的潛在活性成分，再應用UniProt數據庫查找其相應的作用靶點。

1.2 多囊卵巢綜合征相關靶點的篩選GeneCards（https：//www.genecards.org/）是人類基因綜合數據庫，它提供簡明的基因組、蛋白質組、轉錄組、遺傳學和功能學上所有已知和預測的人類基因信息[11]。以“polycystic ovary syndrome”為關鍵詞搜集與多囊卵巢綜合征相關的蛋白。

1.3 加減蒼附導痰湯與多囊卵巢綜合征交集靶基因的篩選及其互作關系（PPI）網絡的構建利用R數據包VennDiagram 1.6.20對加減蒼附導痰湯潛在活性成分靶基因和多囊卵巢綜合征相關的靶基因制作韋恩圖，篩選交集基因。將交集基因輸入在線String 11.0數據庫（https：//string-db.org/），設置基因來源為人源，進行PPI分析，設置0.9置信度，隱藏游離的點，構建PPI網絡。通過R語言包對從數據庫導出的節點TSV.文件進行分析，篩選前10個核心調控基因靶點。

1.4 交集靶基因的基因本體論（GO）分析及京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號通路分析利用R數 據 包colorspace（version 1.4-1）、stringi（version 1.5.3）、DOSE（version 0.9-17）、clusterProfiler（version 3.11）、pathview（version 4.0）將交集靶基因進行GO分析和KEGG信號通路分析，并用BMKCloud（http：//www.biocloud.net/）在線制圖軟件將其結果可視化。

2 結果

2.1 加減蒼附導痰湯潛在活性成分的篩選以OB≥30%、DL≥0.18為篩選條件，篩選出潛在活性成分185個（除去重復的有159個），其中：蒼術9個、香附18個、法半夏13個、陳皮5個、茯苓15個、黃芪20個、石菖蒲4個、皂角刺11個、當歸2個、丹參65個、淫羊藿23個。結果見圖1。

圖1 加減蒼附導痰湯活性成分示意圖Figure 1 Schematic diagram for active ingredients in modified Cangfu Daotan Decoction

2.2 加減蒼附導痰湯與多囊卵巢綜合征交集基因的篩選通過GeneCards數據庫檢索出多囊卵巢綜合征相關靶點2 270個，與藥物活性成分靶點取交集后得到加減蒼附導痰湯治療多囊卵巢綜合征的預測靶點89個（去除組間重復基因），如圖2所示。其中，蒼術的交集基因有14個，香附的交集基因有73個，法半夏的交集基因有22個，陳皮的交集基因有25個，茯苓的交集基因有6個，黃芪的交集基因有67個，石菖蒲的交集基因有24個，皂角刺的交集基因有67個，當歸的交集基因有7個，丹參的交集基因有39個，淫羊藿的交集基因有71個。

圖2 加減蒼附導痰湯-多囊卵巢綜合征靶點交集韋恩圖Figure 2 Venn diagram for intersection between modified Cangfu Daotan Decoction target genes and PCOS target genes

2.3 加減蒼附導痰湯與多囊卵巢綜合征靶標PPI核心網絡的構建將加減蒼附導痰湯與多囊卵巢綜合征交集的89個基因帶入String數據庫進行分析，結果見圖3。PPI結果包含89個節點，878條邊，平均節點的度值為19.7，局部聚類系數為0.588。點的連接線條越多表示關聯度越大，PPI作用關聯度排名前10位的包括：白細胞介素（IL）-6、表皮生長因子受體（EGFR）、血管內皮生長因子A（VEGFA）、胱天蛋白酶3（CASP3）、雌激素受體（ESR1）、原癌基因c-myc（MYC）、絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）、細胞周期蛋白D1（CCND1）、原癌基因c-Fos（FOS）、酪氨酸激酶受體2（ERBB2）。

圖3 加減蒼附導痰湯治療多囊卵巢綜合征的PPI網絡圖Figure 3 PPI network of modified Cangfu Daotan Decoction treatment for PCOS

2.4 交集靶點的GO與KEGG可視化富集分析基于DAVID數據庫，將交集的89個關鍵基因做GO功能富集分析。GO分析結果顯示起主要作用的部分為分子功能（molecular function，MF），P<0.05的條目有83條，基因數目排名前3位的功能有DNA結合轉錄催化劑活性、肽鏈結合、氨基化合物結合，結果見圖4。

圖4 加減蒼附導痰湯-多囊卵巢綜合征交集靶基因的GO分析（分子功能）氣泡圖Figure 4 Bubble diagram for Go analysis（molecular function）of intersection between modified Cangfu Daotan Decoction target genes and PCOS target genes

通過KEGG富集分析共篩選到97條信號通路，且富集到的所有信號通路的P值均小于0.05，排名前20條的通路主要涉及血液剪切應力與動脈粥樣硬化通路、甲狀腺激素信號通路、糖尿病并發癥中的晚期糖基化終末產物-晚期糖基化終末產物受體（AGE-RAGE）信號通路、P53信號通路、內分泌拮抗信號通路、催乳素信號通路、雌激素信號通路，和部分癌癥通路。結果見圖5。

圖5 加減蒼附導痰湯與多囊卵巢綜合征交集靶基因的KEGG信號通路（排名前20位）條形圖Figure 5 Bar diagram for top 20 KEGG signal pathways analysis of intersection between modified Cangfu Daotan Decoction target genes and PCOS target genes

3 討論

本研究應用網絡藥理學技術得到加減蒼附導痰湯185個活性成分，挖掘出136個預測靶點，與已知的2 270個多囊卵巢綜合征相關靶點取交集，最終獲得加減蒼附導痰湯治療多囊卵巢綜合征的89個靶點、878個可能存在的相互作用關系。

加減蒼附導痰湯治療多囊卵巢綜合征的關鍵作用靶點包括IL-6、EGFR、VEGFA、CASP3、ESR1、MYC、MAPK8、CCND1、FOS、ERBB2等。其中：IL-6是常見的炎癥反應因子，已有研究證實，多囊卵巢綜合征小鼠模型卵巢組織中IL-6水平較正常對照組明顯升高[12]，也有研究表明IL-6水平的升高可刺激多囊卵巢綜合征大鼠脂肪細胞，激活AKT/STAT3信號通路，促進細胞增殖[13]。EGFR主要表達于顆粒細胞，臨床研究表明，EGFR在多囊卵巢綜合征患者卵巢組織中表達升高，可影響卵泡發育[14]。VEGF也被認為在多囊卵巢綜合征患者卵巢組織中高表達[15]。研究發現，在接受輔助生殖技術手術的女性中，VEGF是控制卵巢血管生成的關鍵中介，能促進血管內皮細胞分裂繁殖，增強毛細血管通透性，豐富血液供應，激活胚胎著床[16]。已有研究證明，卵巢細胞凋亡可能介導卵泡閉鎖[17]，且卵巢顆粒細胞凋亡發生在卵母細胞凋亡之后[18]。CASP3是凋亡通路的核心功能蛋白，是IL-1β轉換酶家族的成員，同時也是多種凋亡途徑中常見的下游因子[19]。ESR1可影響子宮內膜的容受性，與多囊卵巢綜合征女性早期流產有關[20]，其與多囊卵巢綜合征疾病和藥物靶基因均存在高度相關性[21]。MYC基因作為bHLH-LZ家族一員，常與Max結合形成二聚體嵌入常染色質中[22]，作用于靶向DNA序列（CACGTG）調控眾多基因的轉錄，不僅能夠結合有活性的啟動子，還能夠結合活性增強子[23]，對涉及到細胞增殖、代謝、重編程和RNA生物合成的基因存在正/負調控作用[24]。CCND1作為G1期關鍵的調控蛋白，是研究細胞周期進程的主要指標，與其他細胞周期蛋白相比，其敏感性更高[25]。MAPK8是MAPK炎癥信號通路中的關鍵節點[26]。原癌基因FOS的異常低表達可導致多囊卵巢綜合征患者卵巢顆粒細胞雄激素分泌增加[27]。ERBB2屬于孤兒受體，尚無特異性配體，但同樣具有酪氨酸激酶活性，參與信號傳導系統和細胞生長的調節[28]。有研究表明，ERBB2在原始卵泡啟動生長中起重要的促進作用。亦有研究發現，在原始卵泡啟動生長過程中有ERBB2 mRNA的表達，且隨著卵泡發育逐漸增加[29]。經分析，篩選出的關鍵靶點主要與細胞炎癥、增殖、分化、凋亡等生物學過程有關，故預測加減蒼附導痰湯可能通過調節上述靶點來減輕卵巢組織炎癥，調節卵巢細胞的生長發育及凋亡，進而發揮治療多囊卵巢綜合征的作用。

對加減蒼附導痰湯治療多囊卵巢綜合征相關PPI網絡的構建與生物GO功能富集分析發現，DNA結合轉錄催化劑活性、肽鏈結合、氨基化合物結合是網絡中關鍵靶點的主要富集功能，提示加減蒼附導痰湯可能通過以上功能加快多囊卵巢綜合征的細胞和組織修復。

另外，關鍵交集靶點通路富集分析得到動脈粥樣硬化信號通路、甲狀腺激素信號通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、P53信號通路、內分泌拮抗信號通路、催乳素信號通路、雌激素信號通路等同樣也具有重要的研究意義。動脈粥樣硬化的發生與多囊卵巢綜合征相關，通過對54名多囊卵巢綜合征婦女和60名年齡體質量匹配的健康女性的對比研究發現，多囊卵巢綜合征本身不會增加該類人群罹患動脈粥樣硬化的風險，但多囊卵巢綜合征伴隨肥胖會加重血脂對動脈粥樣硬化的危害作用[30]。而本研究結果發現的加減蒼附導痰湯可作用于多囊卵巢綜合征和動脈粥樣硬化疾病共同的致病靶點，值得進一步深入挖掘。多囊卵巢綜合征患者人群中，甲狀腺疾病的發病率顯著偏高，特別是甲狀腺功能減退比較常見。多囊卵巢綜合征患者存在生殖內分泌紊亂，常合并代謝異常及甲狀腺功能異常，其各系統功能之間存在相關影響，常常互為因果，關系錯綜復雜[31]。而本研究結果得出的交集靶點基因在甲狀腺素通路出現富集，提示加減蒼附導痰湯可能作用于該通路靶點以達到治療作用。糖尿病及其并發癥可導致女性下丘腦-垂體-卵巢軸受損，引起月經異常及子宮、卵巢功能異常，還可導致不孕、妊娠期并發癥以及增加不良妊娠結局風險等[32]。研究[33]表明，通過抑制AGEs/RAGE/核因子kappaB（NF-κB）信號通路，可以降低氧化應激與炎癥反應，減輕組織損傷，維持內環境穩態。另外，AGEs通過RAGE、MAPK和NF-κB信號通路增加了多種組織細胞中脂鈣蛋白2（LCN-2）的表達，提示LCN2可能是改善胰島素抵抗的關鍵靶分子[34-35]。有研究顯示，LCN-2可通過胰島素刺激信號AKT，降低胰島素敏感性，誘發胰島素抵抗[36]。P53作為P53信號通路中的關鍵蛋白，為腫瘤抑制蛋白，可調節多種基因的表達，包括細胞凋亡、生長抑制，抑制細胞周期進程，分化和加速DNA修復，基因毒性和細胞應激后的衰老。且已有研究表明，通過上調P53蛋白的表達可抑制自噬，從而改善多囊卵巢綜合征癥狀[37]。多囊卵巢綜合征是一種常見的內分泌紊亂性疾病，包括高雄激素血癥、高促黃體生成素血癥，雌激素1與雌激素2比例失調[38]。本研究結果得出的關鍵靶點在內分泌拮抗通路上顯著富集，表明加減蒼附導痰湯可通過多靶點調節多囊卵巢綜合征患者內分泌穩態從而發揮治療作用。催乳素具有免疫抑制作用，可通過降低促炎細胞因子的表達，抑制細胞凋亡，減緩炎癥反應和促進組織修復[39]。雌激素是一種類固醇激素，調節哺乳動物多種生理過程，包括生殖、心血管保護、骨完整性、細胞內環境平衡等，雌激素通過原癌基因C-Mer受體激活Ca2+信號通路，影響下游轉錄因子一氧化氮合酶3（NOS3）降低機體胰島素敏感性[40-41]。

綜上所述，推測加減蒼附導痰湯治療多囊卵巢綜合征主要與細胞增殖、分化、凋亡、炎癥等生物學過程有關，可能通過抑制炎癥、凋亡，內分泌調節，組織穩態調節等途徑發揮治療作用。基于上述的研究結果，本課題組下一步擬開展加減蒼附導痰湯治療多囊卵巢綜合征的驗證實驗，以期為加減蒼附導痰湯治療多囊卵巢綜合征提供更多的依據。