黃芩苷對大鼠類風濕性關節炎軟骨損傷的影響

孫標， 鄧翠翠， 王加， 劉超， 王利華

（1.宜昌市中醫醫院骨科，湖北宜昌 443003；2.武漢科技大學附屬醫院骨科，湖北武漢 430000）

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis）是一種慢性、對稱和全身性的自身免疫性關節疾病，其主要特征為滑膜增生、關節和周圍組織炎癥以及骨骼和軟骨組織破損[1-2]。其病因不明，發病機理復雜，可導致關節破壞和畸形，使人們喪失工作能力甚至死亡。目前，類風濕關節炎的治療策略已從使用傳統的非甾體類抗炎藥、糖皮質激素和疾病改良型抗風濕藥變為靶向細胞因子包括腫瘤壞死因子α（TNF-α）、環氧合酶（COX）和白細胞介素（IL）等的生物靶向劑[3-4]，但這些藥物成本高昂且伴有嚴重副作用，包括免疫缺陷、腸胃不適和體液疾病等。中草藥被認為是現代西藥的補充療法，其副作用低，便于抗風濕性關節炎的長期康復治療，恰好彌補了非甾體抗炎藥治療的不足[5]。黃芩，是唇形科植物黃芩Scutelaria baicalensisGeorgi的根，味苦，性寒，無毒，有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎的功效，用于濕溫、暑溫胸悶嘔惡、濕熱痞滿、瀉痢、黃疸、肺熱咳嗽、高熱煩渴、血熱吐衄、癰腫瘡毒、胎動不安等病證的治療。黃芩苷（baicalin）是從黃芩的根部分離出來的一種黃酮類化合物，可抑制炎癥、調控免疫功能[6]，改善類風濕關節炎大鼠癥狀、減輕關節炎炎癥反應，療效較好，不良反應小[7-9]。有研究表明，Janus激酶（JAK）/信號轉導轉錄激活因子3（STAT3）信號通路可調控炎癥反應，激活該信號，可促進類風濕關節炎疾病的進展[10]。為進一步探討黃芩苷治療類風濕關節炎的作用機制，本研究擬觀察黃芩苷對類風濕關節炎大鼠骨組織JAK/STAT3途徑的調控作用，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康SPF級雌性SD大鼠40只，體質量（180±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物質量合格證號：SCXK（京）2016-0011。飼養環境保持溫度在25℃左右，濕度50%~70%，12 h光照，動物自由飲水，3 d換1次墊料，保持鼠籠清潔干燥。所有動物實驗均根據相關的國際實驗動物規則和道德準則進行。

1.2 藥物與試劑黃芩苷（分子量：446.4 g/mol；分子式：C21H18O11；批號：B20570；含量≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司。完全弗氏佐劑（complete Freund’s adjuvant，CFA）（美國Sigma公司）；白細胞介素（IL）-17、IL-23、IL-10酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（美國R&D公司）；抗Osx、Ⅰ型膠原蛋白α1鏈（Col1a1）、Dlx-2、IL-6、IL-10、β-actin等抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；抗JAK1、磷酸化JAK1（p-JAK1）、STAT3、磷酸化STAT3（p-STAT3）等抗體（上海賽信通公司）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒、番紅O染色液、堿性磷酸酶（ALP）檢測試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司）；骨鈣素（osteocalcin）檢測試劑盒（德國羅氏診斷有限公司）。

1.3 儀器CX23光學顯微鏡（日本Olympus公司）；UV-1200紫外分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；XElx800型酶標儀（美國Perkin Elmer公司）；1659001型蛋白電泳儀、小型Trans-Blot轉膜儀（美國Bio-Rad公司）；GIS-500型凝膠成像儀（杭州米歐儀器有限公司）。

1.4 動物模型的構建與給藥適應性喂養7d后，將40只SD大鼠隨機分為5組，即假手術組，模型組，黃芩苷低、中、高劑量組，每組各8只。除假手術組大鼠右后足墊皮內一次性注射0.1 mL生理鹽水之外，其余各組大鼠均于右后足墊皮內一次性注射0.1 mL完全弗氏佐劑誘導類風濕關節炎模型（為第1天）[11]。按照以下關節炎癥狀評分法，每天進行評估：正常爪，計0分；腳趾紅斑，計1分；腳掌紅斑和腫脹，計2分；腳踝腫脹，計3分；整個腿完全腫脹，計4分；無法彎曲，計6分。每只大鼠的關節炎指數是將4個單獨爪的分數相加得出的[12]。第1~13天觀察關節炎癥狀，當至少1只未注射的爪發炎時，則判斷類風濕關節炎模型建立成功，當第10~13天，大鼠關節炎癥狀已達高峰。成功造模后，第14~28天，黃芩苷低、中、高劑量組每天在同一時間分別給予對應劑量為25、50、100 mg/kg的黃芩苷（溶于生理鹽水配制）灌胃，假手術組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 骨小梁間距測量 給藥結束后，以戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉大鼠后，顯微CT掃描股骨測量骨小梁間距（Tb.Sp）。

1.5.2 HE染色法觀察關節組織病理變化 取大鼠踝關節組織，以10%乙二胺四乙酸（EDTA）脫鈣，包埋在石蠟中，石蠟切片后用HE染色，然后在光學顯微鏡下觀察關節組織病理變化。

1.5.3 番紅O染色法觀察軟骨損傷情況 取膝關節，脫鈣、包埋、石蠟切片后番紅O染色液內浸染，分化液洗滌切片，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹脂封固后，在光學顯微鏡下觀察軟骨病理改變。

1.5.4 血清ALP、骨鈣素的檢測 按ALP檢測試劑盒和骨鈣素檢測試劑盒說明書操作。使用紫外分光光度計檢測510 nm波長處吸光度值，計算大鼠血清ALP含量；使用酶標儀檢測450 nm波長處吸光度值，計算大鼠血清骨鈣素含量。

1.5.5 蛋白免疫印跡法檢測股骨組織Osx、Col1a1、Dlx-2、IL-6、IL-10、JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3表達 取股骨組織，提取總蛋白，用Nanodrop 2000測量蛋白質濃度并調平后，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白質，再將其轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。接下來，用含有50 g/L脫脂牛奶的Tris-HCl緩沖鹽吐溫溶液（TBST）將膜封閉2 h。然后，將膜與抗Osx抗體4℃孵育過夜。TBST洗滌3次，與辣根過氧化物酶（HRP）偶聯的抗體37℃孵育1 h。TBST洗滌3次，加入增強的化學發光液，應用凝膠成像儀曝光，對電泳條帶灰度值進行分析。Col1a1、Dlx-2、IL-6、IL-10、JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3、β-actin等指標的檢測方法同上。

1.5.6 ELISA法檢測血清炎癥因子IL-10、IL-17、IL-23含量 麻醉大鼠后，摘取眼球取血，靜止30 min，以3 000 r/min（離心半徑8.5 cm）4℃離心10 min，分離出上層血清，按照ELISA試劑盒說明書操作，應用酶標儀于波長450 nm處測定吸光度值，計算血清IL-10、IL-17、IL-23的含量。

1.6 統計方法采用SPSS 21.0統計軟件進行數據分析，實驗數據以均數±標準差（±s）表示，進行正態分布檢驗和方差齊性檢驗。所有數值均符合正態分布和方差齊性，多組比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠關節組織病理變化比較圖1結果顯示：假手術組大鼠滑膜和軟骨組織結構正常，滑膜細胞排列整齊，軟骨表面光滑，關節腔內未見滲出液，無炎性細胞浸潤；模型組大鼠關節表面不平整，周圍大量中性粒細胞浸潤，滑膜增生肥厚，纖維組織增生，軟骨及骨骼損傷；與模型組比較，黃芩苷中、高劑量組大鼠滑膜增生、炎性細胞浸潤、軟骨表面侵蝕和關節變性顯著減輕。表明黃芩苷可顯著改善類風濕關節炎大鼠軟骨損傷。

圖1 各組大鼠關節組織病理變化比較（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of the pathologicalchanges in rat knee joint tissue of various groups（by HE staining，×200）

2.2 各組大鼠骨小梁間距，血清ALP、骨鈣素含量的比較圖2結果顯示：與假手術組比較，模型組骨小梁間距增寬，血清ALP和骨鈣素含量降低（P<0.05）；與模型組比較，黃芩苷中、高劑量組骨小梁間距顯著減小，血清ALP和骨鈣素含量顯著升高（P<0.05）。

圖2 各組大鼠骨小梁間距，血清堿性磷酸酶（ALP）、骨鈣素含量的比較Figure 2 Comparison of the trabecular bone spacing and serum contents of ALP and osteocalcin in various groups

2.3 各組大鼠軟骨損傷情況及成骨標記蛋白Osx、Col1a1、Dlx2表達的比較圖3結果顯示：假手術組軟骨基質呈紅色，結構規則，基質較豐厚；模型組軟骨基質蛋白多糖流失幾乎不著色，缺損部位深及軟骨層鈣化，軟骨下骨小梁結構疏松紊亂，且股骨組織中Osx、Col1a1、Dlx2表達水平均顯著下調（P<0.05）；與模型組比較，黃芩苷處理組尤其是高劑量組顯著改善軟骨損傷，軟骨基質恢復充盈，結構恢復規則致密，且黃芩苷中、高劑量組股骨組織中Osx、Col1a1、Dlx2表達水平顯著上調（P<0.05）。

圖3 各組大鼠軟骨損傷情況及成骨標記蛋白Osx、Col1a1、Dlx2表達的比較Figure 3 Comparison of the cartilage damage status and expression levels of marker Osx，Col1a1 and Dlx2 of osteogenic differentiation in various groups

2.4 各組大鼠炎癥因子IL-17、IL-23、IL-6、IL-10水平的比較圖4結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠血清IL-17、IL-23、IL-10含量均顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，黃芩苷中、高劑量組呈劑量依賴性顯著降低血清IL-17、IL-23含量，升高血清IL-10含量（P<0.05）。IL-6和IL-10蛋白表達的趨勢與上述結果一致。

圖4 各組大鼠炎癥因子IL-17、IL-23、IL-6、IL-10水平的比較Figure 4 Comparison of the levels of inflammatory factor IL-17，IL-23，IL-6，IL-10 in various groups

2.5 各組大鼠股骨組織JAK1、STAT3磷酸化水平比較圖5結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠股骨組織p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3的蛋白相對表達量顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，黃芩苷中、高劑量組p-JAK1/JAK1、p-STAT3/STAT3的蛋白相對表達量顯著下降（P<0.05），黃芩苷低劑量組的差異無統計學意義（P>0.05）。

圖5 各組大鼠股骨組織JAK1、STAT3磷酸化水平比較Figure 5 Comparison of JAK1 and STAT3 phosphorylation levels in femur tissue in various groups

3 討論

越來越多的研究[7-9，13]表明，黃芩苷可有效治療類風濕關節炎，但其機制尚不完全明確。完全弗氏佐劑誘發的關節炎是臨床前研究中常用的動物模型，其病理特征如血管生成、炎性細胞浸潤、軟骨細胞降解和骨侵蝕與人類類風濕關節炎非常相似。因此，該模型被廣泛用于類風濕關節炎的基礎研究和抗類風濕關節炎藥物的開發[14]。本研究通過在大鼠右后足墊皮內注射完全弗氏佐劑構建了類風濕關節炎模型，病理組織切片結果可見類風濕關節炎模型大鼠關節表面不平整，周圍大量中性粒細胞浸潤，滑膜增生肥厚，軟骨及骨骼損傷，表明類風濕關節炎模型構建成功。給予黃芩苷干預后，類風濕關節炎大鼠軟骨的破壞及炎癥反應明顯改善，滑膜增生、炎性細胞浸潤和軟骨破損顯著減輕，表明黃芩苷對類風濕關節炎具有潛在的保護作用。

ALP和骨鈣素均由成骨細胞合成分泌。ALP的活性是反映成骨細胞分化程度和功能狀態的良好指標[15]。骨鈣素是骨組織的特異性蛋白，目前認為血清骨鈣素是反映成骨細胞功能的標志物[16]。骨小梁間距，可反映骨小梁結構形態的變化。本研究結果顯示：類風濕關節炎大鼠骨小梁間距顯著變寬，ALP和骨鈣素含量顯著降低，黃芩苷能夠逆轉骨小梁間距，恢復骨小梁正常結構，且能顯著增加ALP和骨鈣素含量。表明黃芩苷能夠促進類風濕關節炎大鼠的骨分化，改善骨小梁結構。

類風濕關節炎的關節滑膜炎癥和增生導致血管翳形成，進而侵犯關節軟骨，最終導致骨關節畸形和功能喪失[11]。當軟骨受到損傷時，軟骨中的糖蛋白會釋放出來，使基質成分分布不均勻，導致番紅O淡染或不著色[17]。本研究番紅O染色結果顯示，假手術組大鼠軟骨基質呈紅色，結構規則，基質較豐厚，模型組大鼠軟骨基質幾乎不著色，表明模型組大鼠軟骨基質蛋白多糖流失嚴重。且模型組大鼠股骨勻漿中成骨細胞分化和骨形成過程中的關鍵調控因子Osx、Col1a1和Dlx2表達水平均顯著下調。但經黃芩苷干預后，軟骨病理損傷得到顯著改善，Osx、Col1a1和Dlx2表達水平顯著上調，故表明黃芩苷可顯著逆轉類風濕關節炎大鼠軟骨損傷。

有研究證實，患者血清或關節炎中促炎性細胞因子IL-6、IL-17和IL-23，抗炎性細胞因子IL-10的水平，與關節的損壞和破壞密切相關[18-19]。抑制這些促炎性細胞因子、促進抗炎性細胞因子水平對類風濕關節炎有積極的治療作用。本研究結果顯示，類風濕關節炎大鼠血清IL-17、IL-23和IL-10表達水平均顯著上調，給予黃芩苷尤其是100 mg/kg劑量處理后，IL-17和IL-23表達水平顯著下調，抗炎因子IL-10表達水平顯著上調，表明黃芩苷通過其抗炎作用可減輕類風濕關節炎炎癥反應。

JAK1/STAT3作為介導類風濕關節炎的發生及疾病進展的信號通路，可廣泛參與促炎因子TNF-α和IL-6等的合成轉化，在免疫炎癥過程中具有重要的調節作用，抑制該信號的活化可減輕類風濕關節炎的臨床癥狀，延緩疾病的進展[20-21]，且JAK/STAT途徑的選擇性抑制劑CP-690550已開發用于類風濕關節炎的治療[22]。本研究結果顯示，黃芩苷能夠顯著降低類風濕關節炎大鼠骨組織中JAK1和STAT3的磷酸化水平，表明黃芩苷可通過抑制JAK1/STAT3通路的活性減輕類風濕關節炎。

綜上所述，黃芩苷可有效改善類風濕關節炎大鼠的軟骨損傷，其機制可能與其抑制JAK1/STAT3途徑的活化進而抑制炎癥反應，從而阻止關節炎病變進程有關。故預測黃芩苷可能成為治療類風濕關節炎的新型藥物。