肝藏血中肝郁血滯病機的實驗探查

錢夢， 岳晨， 楊宗純， 朱昊如， 范方馨， 謝鳴

（北京中醫藥大學方劑學系，北京 100029）

肝郁血滯是指肝氣郁滯與血行不暢并存的一種病理變化。中醫學認為，氣行則血行，氣滯則血滯或血瘀。肝藏血是指肝具有攝血、貯藏血液和調節血量的功能[1]。若肝不藏血可導致貯血不足，肝血虧虛，甚或不能制約肝陽，肝陽上亢，收攝失常引起出血諸證。肝主疏泄是指肝具有疏達舒發、調暢氣機的功能，與肝藏血的功能密切相關。肝之疏泄有度，氣機調暢，才能有效地儲藏、調節、收攝血液；當肝疏泄不及，氣機不暢，則可引起血行不暢，甚則留而成瘀[2]，所謂“氣結則血凝”（《血證論》）。但目前有關“肝藏血”內涵多側重于肝疏泄太過或肝陽亢旺引起的出血方面[3]，有關疏泄不及導致的血行不暢的探討較少。從中醫病機的角度來看，肝郁與血滯作為不同的病理環節，二者在病機演變中存在相互關系，特別是肝臟在氣郁血滯證中扮演的角色及其現代病理生理學內涵尚不清楚。目前了解到中醫血瘀證可能涉及血郁、血滯、血瘀、血結等不同類型，但血行障礙則是其共同的病理生理特點，血液循環和微循環障礙、血液高黏滯狀態以及血小板活化和黏附聚集性增強是中醫血瘀證的重要病理生理學基礎[4]。基于中醫氣血相關及肝主藏血的理論和現代有關血瘀證內涵的認識，本研究擬在前期觀察到的束縛應激肝郁大鼠模型伴有血液黏度異常[5]的基礎上，進一步動態觀察該模型復制過程中血液流變及凝血功能的變化，以探查肝郁證形成及發展中血液運行的功能狀態，為認識中醫“肝藏血”及“肝郁血滯”病機的現代內涵提供一定的實證理解，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物健康雄性Wistar大鼠40只，體質量210~220 g，級別SPF/VAF，動物許可證號為SCXK（京）2012-0001，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。所有動物提前3 d購入，于動物房適應性常規飼養。飼養條件：光照節律12-12 h（6∶00 a.m.—6∶00 p.m.），溫度20~25℃，相對濕度50%±5%。本次實驗方案獲得了北京中醫藥大學倫理委員會的批準（編號：BUCM-4-2018060415-2019）。

1.2 試劑大鼠皮質酮（CORT）酶聯免疫檢測試劑盒（批號：20190316.60170R）、大鼠5-羥色胺（5-HT）酶聯免疫檢測試劑盒（批號：20190316.60087R）、大鼠去甲腎上腺素（NE）酶聯免疫檢測試劑盒（批號：20190316.60075R）、血漿抗凝蛋白C（PC）酶聯免疫檢測試劑盒（批號：20190316.60441R）、游離蛋白S（FPS）酶聯免疫檢測試劑盒（批號：20190316.60398R）、抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）酶聯免疫檢測試劑盒（批號：20190316.60473R），以上試劑盒均由北京瑞格博生物技術有限公司提供。

1.3 儀器自制束縛筒為有機玻璃制成的圓筒狀結構，主筒長25 cm，筒口外徑7 cm，內徑5 cm。前端置有一直徑小于主筒的、可以前后調節的帶有透氣孔的、便于大鼠頭伸進的有機玻璃前罩，后端為可調節間距的開關閥門。

曠場實驗箱：木質，100 cm×100 cm×40 cm，內壁為黑色，底部線條為白色，箱底被劃分為25個全等正方形格子，中心9個格作為中心區域，其余周邊格為周圍區域。敞箱頂部的攝像頭視野覆蓋整個曠場箱。采用The Observer Video-Pro&Echo Vision 3.0系統分析大鼠的行為。

Beckmancoulter UniCel DxC 600 Synchron全自動生化分析儀（美國Beckmancoulter公司）；Thermo Multiskan MK7全自動酶標儀[Thermo（原芬蘭雷勃）公司]；ACL TOP全自動血凝分析儀（美國Beckman Coulter公司）；LBY-N6C全自動血流變儀（北京普利生公司）。

1.4 造模方法參考文獻[6]采用慢性束縛應激的方法復制肝郁證大鼠模型：將大鼠放入有機玻璃束縛裝置中，每天束縛3 h（8∶00—11∶00 a.m.），連續造模28 d。

1.5 分組處理健康雄性Wistar大鼠40只，適應性喂養3 d后，隨機分為正常組和模型組，每組各20只。造模組大鼠按上述方法造模，正常組不予任何處理，2組均常規飼養。分別于實驗2周末和4周末隨機挑選正常組與模型組各10只大鼠進行糖水與曠場試驗，處殺并低溫取下丘腦及收集血液樣本，進行相應指標檢測。

1.6 檢測指標

1.6.1 行為學指標

1.6.1 .1 一般外觀表征 于實驗進行的每周二和周六觀測并記錄各組大鼠的一般外觀行為（行為狀態、活躍程度、情緒反應、睡眠狀態）的變化，并給予評分。外觀行為的各項評分標準參考文獻[7]。統計每周各組大鼠外觀行為各項積分的變化，取每周2次觀測的均值。最后，將性質相近的外觀表征合并為2個指標群（活動狀態、情緒睡眠），并分別統計各指標群的積分。

1.6.1 .2 糖水偏嗜試驗 參考文獻[8]于造模第2周末和第4周末進行糖水試驗測試。具體操作方法：每只動物單籠飼養，分別給予2瓶100 mL的水。第1個24 h內，2瓶水均為1%蔗糖水；第2個24 h內，給予1瓶1%蔗糖水，1瓶蒸餾水；第3個24 h內，動物禁食禁水；于第4個24 h內，進行糖水/純水偏嗜試驗，給予每只大鼠1瓶1%蔗糖水，1瓶蒸餾水，自由飲水1 h后取出2瓶水，并對2瓶稱質量，記錄大鼠的糖水消耗量與純水消耗量并計算糖水偏嗜度。糖水偏嗜度=（糖水消耗量/總液體消耗量）100%。

1.6.1 .3 曠場試驗 參考文獻[9]于實驗的第2周末和第4周末進行。將大鼠緩慢放入黑色敞箱底部中央后開始同步錄像，每只大鼠計時5 min，記錄大鼠5 min內的運動軌跡，存檔后待分析。實驗保證在室內光線柔和、安靜的條件下進行，并于每只大鼠測試結束后清理尿液和糞便，再進行下只大鼠的測試。

1.6.2 實驗室指標 ①下丘腦：NE，酶聯免疫法檢測。②血漿：CORT、5-HT、AT-Ⅲ、PC和FPS，酶聯免疫法檢測。③全血：血液流變學，血流變儀檢測；凝血4項[凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶時間（TT）、纖維蛋白原（FIB）]，發色底物法檢測；血小板聚集率，二磷酸腺苷（ADP）誘導法檢測。

1.7 統計方法釆用SPSS 20.0統計軟件分析處理全部數據，計量資料以均值±標準差（±s）表示。2組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差析（one-way ANOVA）進行檢驗后，采用Student Newman Keuls Test檢驗；非正態分布采用非參數檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。所有圖表均用GraphPad Prism 7軟件制作。

2 結果

2.1 造模不同時間點的中醫證候外觀表征的變化

2.1.1 體質量和一般外觀表征的變化 由表1可見，正常組和模型組大鼠體質量由第1~4周均逐漸增加，其中，正常組大鼠的增長速度高于模型組。與正常組比較，模型組大鼠第1~4周的體質量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。從表2中可以看出，與正常組比較，模型組大鼠第1~4周活動狀態積分明顯升高（P<0.01）。從表3中可以看出，與正常組比較，模型組大鼠第1~4周情緒睡眠積分明顯升高（P<0.01）。

表1 肝郁模型大鼠不同時間點體質量的變化Table 1 Comparison of the changes of body mass in rats with liver stagnation syndrome at different time points （±s，g）

表1 肝郁模型大鼠不同時間點體質量的變化Table 1 Comparison of the changes of body mass in rats with liver stagnation syndrome at different time points （±s，g）

①P<0.05，②P<0.01，與正常組比較

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表2 肝郁證模型大鼠不同時間點活動狀態積分的變化Table 2 Comparison of the changes of active state in rats with liver stagnation syndrome at different time points （±s，分）

表2 肝郁證模型大鼠不同時間點活動狀態積分的變化Table 2 Comparison of the changes of active state in rats with liver stagnation syndrome at different time points （±s，分）

①P<0.01，與正常組比較

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表3 肝郁證模型大鼠不同時間點情緒睡眠積分的變化Table 3 Comparison of the changes of emotionalsleep scores in rats with liver stagnation syndrome at different time points （±s，分）

表3 肝郁證模型大鼠不同時間點情緒睡眠積分的變化Table 3 Comparison of the changes of emotionalsleep scores in rats with liver stagnation syndrome at different time points （±s，分）

①P<0.01，與正常組比較

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2.1.2 糖水實驗和曠場實驗 各組大鼠糖水實驗的結果見表4。由表4可見，與正常組比較，模型組大鼠第2周和第4周糖水偏嗜度均明顯降低（P<0.05或P<0.01）。

表4 肝郁證模型大鼠不同時間點糖水偏嗜度變化Table 4 Comparison of the changes of sugar water preference in rats with liver stagnation syndrome at different time points （±s，%）

表4 肝郁證模型大鼠不同時間點糖水偏嗜度變化Table 4 Comparison of the changes of sugar water preference in rats with liver stagnation syndrome at different time points （±s，%）

①P<0.05，②P<0.01，與正常組比較

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各組大鼠曠場實驗的結果見表5。由表5可見，與正常組比較，模型組大鼠第2周爬行里程數明顯增加（P<0.01），中央區停留時間明顯降低（P<0.05），第4周爬行里程數與中央區停留時間均明顯降低（P<0.05或P<0.01）。

表5 肝郁證模型大鼠不同時間點的自主行為變化Table 5 Comparison of the changes of autonomic behaviors in rats with liver stagnation syndrome at different time points （±s）

表5 肝郁證模型大鼠不同時間點的自主行為變化Table 5 Comparison of the changes of autonomic behaviors in rats with liver stagnation syndrome at different time points （±s）

①P<0.05，②P<0.01，與正常組比較

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2.2 造模不同時間點實驗室指標的變化

2.2.1 神經-內分泌相關指標的變化 由表6可以看出，與正常組比較，模型組大鼠第2周和第4周的血漿5-HT水平均明顯降低（P<0.05或P<0.01），第4周下丘腦NE水平明顯降低（P<0.01），血漿CORT水平明顯升高（P<0.05）。

表6 肝郁證模型大鼠不同時間點實驗室指標的變化Table 6 Comparison of the changes of laboratory indexes in rats with liver stagnation syndrome at different time points （±s）

表6 肝郁證模型大鼠不同時間點實驗室指標的變化Table 6 Comparison of the changes of laboratory indexes in rats with liver stagnation syndrome at different time points （±s）

①P<0.05，②P<0.01，與正常組比較

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2.2.2 血液流變及凝血功能相關指標的變化

2.2.2 .1 血液流變學的變化 表7結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠第4周全血黏度低切、中切、高切以及血漿黏度均升高，但差異無統計學意義（P>0.05）。由表8可以看出，與正常組比較，模型組大鼠第4周全血黏度低切、中切、高切以及血漿黏度均明顯升高（P<0.01）。

表7 肝郁證模型大鼠第2周血液流變的變化Table 7 Comparison of the hemorheologicalchanges in rats with liver stagnation syndrome in the second week（±s）

表7 肝郁證模型大鼠第2周血液流變的變化Table 7 Comparison of the hemorheologicalchanges in rats with liver stagnation syndrome in the second week（±s）

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表8 肝郁證模型大鼠第4周血液流變的變化Table 8 Comparison of the hemorheological changes in rats with liver stagnation syndrome in the fourth week（±s）

表8 肝郁證模型大鼠第4周血液流變的變化Table 8 Comparison of the hemorheological changes in rats with liver stagnation syndrome in the fourth week（±s）

①P<0.01，與正常組比較

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2.2.2 .2 凝血4項的變化 由表9、10可以看出，與正常組比較，模型組大鼠第2周PT、APTT、TT均明顯降低（P<0.01），FIB明顯升高（P<0.05），第4周PT和APTT均明顯降低（P<0.01），FIB明顯升高（P<0.05），TT降低但差異無顯著性意義（P>0.05）。

表9 肝郁證模型大鼠第2周凝血4項的變化Table 9 Comparison of the changes of four blood coagulation indexes in rats with liver stagnation syndrome in the second week （±s）

表9 肝郁證模型大鼠第2周凝血4項的變化Table 9 Comparison of the changes of four blood coagulation indexes in rats with liver stagnation syndrome in the second week （±s）

①P<0.05，②P<0.01，與正常組比較

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2.2.2 .3 血小板聚集率的變化 由表11可以看出，與正常組比較，模型組大鼠實驗第2周的3 min血小板聚集率明顯升高（P<0.01）；第4周的1、3、5 min血小板聚集率均明顯升高（P<0.01）。

表11 肝郁證模型大鼠不同時間點血小板聚集率的變化Table 11 Comparison of the changes of platelet aggregation rate in rats with liver stagnation syndrome at different time points （±s）

表11 肝郁證模型大鼠不同時間點血小板聚集率的變化Table 11 Comparison of the changes of platelet aggregation rate in rats with liver stagnation syndrome at different time points （±s）

①P<0.01，與正常組比較

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表10 肝郁證模型大鼠第4周凝血4項的變化Table 10 Comparison of the changes of four blood coagulation indexes in rats with liver stagnation syndrome in the fourth week （±s）

表10 肝郁證模型大鼠第4周凝血4項的變化Table 10 Comparison of the changes of four blood coagulation indexes in rats with liver stagnation syndrome in the fourth week （±s）

①P<0.01，與正常組比較

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2.2.2 .4 血漿抗凝輔助因子的變化 由表12可以看出，與正常組比較，模型組大鼠血漿PC、FPS、AT-Ⅲ的表達水平均明顯降低（P<0.01）。

表12 肝郁證模型大鼠抗凝輔助因子的變化Table 12 Comparison of the changes of anticoagulation cofactor in rats with liver stagnation syndrome （±s）

表12 肝郁證模型大鼠抗凝輔助因子的變化Table 12 Comparison of the changes of anticoagulation cofactor in rats with liver stagnation syndrome （±s）

①P<0.01，與正常組比較

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3 討論

3.1 肝郁證模型的復制與評價肝郁證動物模型復制方法較多[10-11]，目前學界多傾向于基于中醫發病學特點采用情志刺激法誘導的相關模型，如捆綁束縛法[12]、夾尾激怒法[13]和不可預知慢性刺激法[14]等，模型評價標準通常包括中醫證候外觀表征、相關實驗室指標、糖水偏嗜實驗和曠場實驗[15-17]等在內的多項綜合指標體系。

研究發現，采用孤養聯合慢性不可預見性溫和刺激法[18]和孤養聯合慢性束縛應激法[19]誘導3周的肝郁證模型大鼠隨著造模時間的延長逐漸出現體毛干枯、活動減少、精神萎靡等癥狀，第2周與第3周糖水偏嗜度明顯降低，穿格次數明顯降低、中央區停留時間明顯增加，皮質及海馬內5-HT含量明顯降低，血漿CORT明顯升高；采用慢性束縛應激法4周建立的肝郁證模型大鼠的糖水偏嗜度明顯降低，皮質內5-HT和NE表達明顯降低，外周血CORT含量顯著增加[20]。表明肝郁證動物不僅表現出心情低落，情緒調節的障礙，而且伴有中樞與外周5-HT和NE水平的異常和HPA功能的亢進。

本研究發現，采用束縛應激法誘導的肝郁證模型大鼠在第1~2周出現躁動、易激惹等表現，曠場試驗中的爬行里程數明顯增加，但隨著時間的延長至束縛第4周時則表現出萎靡、少動、扎堆、反應遲緩等表現；模型大鼠在第2~4周時糖水消耗率明顯降低，曠場試驗中的爬行里程數、中央區停留時間均明顯降低，出現貼邊，探索減少。表明模型大鼠具有階段性發展，即中樞由興奮逐漸轉為抑制的特點。本研究也觀察到，該模型大鼠下丘腦NE、血漿5-HT含量在第2周和第4周均明顯降低，同時，血漿CORT持續升高，表明模型大鼠出現交感活性的降低和HPA軸功能亢進。故該模型符合中醫肝郁證外觀表征和神經-內分泌變化特征[21]。

3.2 肝郁證模型大鼠的血液流變學狀態中醫學認為，肝主藏血，參與全身血行的調節，肝氣郁滯會影響到肝藏血的功能。既往臨床研究曾觀察到，肝郁證患者血漿還原黏度和血沉方程K值明顯升高[22]，肝郁氣滯型原發性開角型青光眼患者低、中、高切變率下的全血黏度明顯升高[23]。有實驗研究發現：采用夾尾法2 d復制的肝郁證模型大鼠血小板聚集率、血沉、全血黏度及血漿黏度均明顯增加[24]；采用束縛四肢法2周建立的肝郁模型大鼠不同切變率下的全血黏度和血漿黏度明顯升高[25]。結果提示，肝郁證存在血液流變學方面的異常，但有關中醫肝藏血內涵及肝郁與血滯在病機上的聯系尚不清楚。

已知血液流變可直接反映血液流動性、凝滯性和血液黏度的變化；凝血4項包括PT、APTT、TT、FIB，是目前臨床用于評估凝血功能最常見的指標[26]。其中，PT與APTT反映血漿中凝血因子水平，是評估凝血功能的主要指標；TT為纖維蛋白原轉化為纖維蛋白所需時長，反映血漿中有無出血抗凝物和是否存在纖溶現象；FIB是纖維蛋白的前體，反映血中纖維蛋白原的含量，纖維蛋白原可通過凝血酶酶促轉化為纖維蛋白，起到阻塞血管，防止過度出血的作用，其含量高低表明機體是否處于高凝狀態[27-28]。血小板聚集試驗主要反映血小板的聚集功能，其聚集強度與血液高凝狀態密切相關。這些指標均在一定程度上反映了機體血液流行狀態。為全面地探討肝郁與血行之間的關系，本研究對肝郁大鼠模型復制過程中反映血液流行狀態的相關指標進行了動態觀察。

結果觀察到，造模2周時的大鼠全血黏度和血漿黏度、血小板聚集率與正常組大鼠無顯著區別，但至第4周時10/s、60/s、150/s不同切變率下的全血黏度和血漿黏度均顯著升高，1、3、5 min的血小板聚集率均明顯升高，表明慢性束縛中的持續應激可使模型大鼠血液黏度增高。本研究還觀察到，模型大鼠造模第2周和4周時的PT、APTT、TT均顯著縮短，FIB明顯升高，表明大鼠在模型復制早期的血凝狀態即呈增強趨勢，且隨著造模時間的延長，進一步出現血液黏度增高，凝血功能增強，并處于高凝狀態，此與模型大鼠隨著造模時間的延長，肝郁外觀表征和神經-內分泌異常變化的顯現及加重的結果相一致，提示肝郁發展中伴隨有血液流變方面的異常變化，此可為中醫肝郁血滯的病機聯系提供一定的現代理解。

3.3 肝郁證模型大鼠血液流變異常的機制肝臟在維持凝血狀態的平衡中有著非常重要的作用。肝臟不僅是大部分凝血因子生成分泌的臟器，而且還能夠通過產生AT-Ⅲ和PC等抗凝輔助因子來抑制血液高凝及異常的血栓生成。其中：AT-Ⅲ與激活的凝血因子結合、水解，從而阻斷凝血級聯[29]；PC活化后與FPS結合，降解凝血因子Va和Ⅷa，防止其活化形成凝血酶，達到抑制血小板活化的作用。由此可以看出，肝臟通過產生凝血因子和抗凝輔助因子，調節凝血/抗凝血的平衡，以維持血液正常流行狀態。本研究觀察到，束縛4周的大鼠血漿抗凝輔助因子PC、FPS、AT-Ⅲ明顯降低，結合該模型大鼠出現血液黏度和血小板聚集性增高，血漿PT和APTT縮短及FIB升高等變化，推測肝臟對凝血和抗凝輔助因子的生成調節可能參與該模型大鼠的血液流變異常的病理發生，也可能是中醫學肝郁與血滯病機關聯的臟腑病理生理學基礎之一。

3.4 中醫肝郁證與現代抑郁癥目前認為，中醫肝郁證與現代抑郁癥二者甚為類近，其在內涵上有很多交集[30-33]。臨床研究曾觀察到：中醫肝郁證患者血漿還原黏度和血沉方程K值明顯升高[22]，全血黏度明顯升高[23]；抑郁癥患者纖維蛋白原[34]、血小板的活化[35]和聚集率[36]均明顯增加，且纖維蛋白原水平和血小板活化程度均與抑郁癥嚴重程度相關[34-35]。本研究采用的慢性束縛應激法也是抑郁癥動物模型復制的常用方法之一[37]。既往曾有研究發現，慢性束縛應激可以增強小鼠血小板激動劑凝血酶和ADP刺激血小板聚集的能力[38]。本次研究觀察到，束縛應激模型大鼠不僅出現中醫肝郁證的外部表現和相關實驗指標的異常，而且伴有血流變障礙及凝血和血小板聚集功能的增強，這與由其他方法復制的抑郁癥動物模型所表現出的神經-內分泌[39]和血液學異常[40]具有較多的類同，進一步證明中醫肝郁與西醫抑郁癥二者在病理生理學方面具有的同質性。提示該法建立的中醫肝郁模型用于抑郁癥中醫藥防治及其機制研究方面具有潛在價值。

本研究動態觀察了肝郁證模型大鼠造模過程中的中醫證候和血液流變/凝血狀態的變化，結果顯示：束縛過程中大鼠經歷由早期的神經興奮狀態逐漸轉為抑郁狀態的變化過程，束縛4周不僅表現出少動喜靜、行動遲緩、情緒低落等抑郁狀態，而且伴有交感神經活性降低和HPA軸的亢進等神經內分泌變化特點。大鼠束縛第2周即出現凝血活性的增強，至第4周進一步出現全血黏度和血漿黏度及血小板聚集率的顯著升高，血液呈現出一定程度的高凝狀態，同時，血中源于肝臟的凝血因子增強和抗凝輔助因子降低。表明隨著肝郁的形成及發展，逐漸出現血行方面的障礙，肝臟可能參與了其中的部分調節，但其確切的機制有待進一步研究。本研究為揭示中醫“肝藏血”及“肝郁血滯”病機的現代內涵提供了一定的實驗依據。