大鼠脊髓撞擊損傷模型的建立和鑒定

林 翔，劉蔚楠，林家鐘，王榮茂

（福建中醫藥大學附屬人民醫院，福建福州350004）

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是常見的嚴 重的中樞神經損傷性疾病，常致患者截癱，嚴重影響患者身心健康，給家庭和社會帶來沉重負擔。穩定、可靠的脊髓損傷模型是研究脊髓損傷機制及治療方法的前提，本研究旨在Allen′s法造模原理基礎上設計出一種經濟、操作簡單、穩定性高、臨床相似度好、易于推廣的脊髓撞擊損傷模型，為脊髓損傷研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 成年健康清潔級SD大鼠，雌雄不限，體質量300 g左右，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供［許可證號：SCXK（滬）2007-0005］。

1.1.2 儀器與試劑 生物顯微鏡（Olympus，Japan），體式顯微鏡（Olympus，Japan），數碼相機（Olympus，Japan），肌電圖－誘發電位記錄儀（Nicolet-Viking膝上型），自制脊髓損傷打擊器（圖1，主要由套管及30 g克氏針組成），10%水合氯醛，4%多聚甲醛，0.5%伊紅液，蘇木素染色液，80%乙醇，90%乙醇，95%乙醇，無水乙醇，二甲苯。

1.2 實驗方法

脊髓撞擊損傷模型建立：SD大鼠32只，按隨機數字法隨機分為A、B、C、D 4組，每組8只。以10%水合氯醛腹腔注射，麻醉后將大鼠俯臥位固定于手術臺板上，背部剃毛，常規消毒鋪巾。以與最低位肋骨相連的椎骨（T12）作為定位標志，以T10棘突為中心作長約3 cm的后正中切口，暴露T9-11棘突及椎板，切除T10椎板，充分暴露脊髓T10段。將1 mm厚小墊片貼附在硬脊膜上，用30 g克氏針沿套管從不同高度自由墜落（A組墜落高度為1.5 cm，B組墜落高度為2.0 cm，C組墜落高度為2.5 cm，D組墜落高度為3.0 cm，撞擊沖量=質量×高度），垂直打擊直接造成脊髓損傷，撞擊脊髓后克氏針在脊髓表面停留5 s。如局部脊髓迅速水腫、瘀血，大鼠全身迅速回縮樣抖動，提示撞擊模型成功。關閉切口，大鼠單籠飼養，用青霉素4×104U/d抗感染，連用3 d。

1.3 檢測指標

1.3.1 組織學觀察 術后14 d所有實驗大鼠采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，沿胸骨柄剪開胸腔，暴露心臟，將灌注針頭插入主動脈，快速用生理鹽水沖洗血液后，再用4%多聚甲醛灌流固定1.5 h。以損傷區域為中心切取約1 cm長的脊髓組織，用4%多聚甲醛溶液浸泡固定2 h后常規石蠟包埋，連續橫向切片，行HE染色顯微鏡下觀察脊髓損傷區域結構。

1.3.2 行為學觀察 各組大鼠在造模前1 d，造模后1 d、3 d、7 d、14 d按Tarlov評分標準行神經功能評定。以0～2分為截癱，采用雙人雙盲獨立評分后取平均值。

1.3.3 神經電生理檢測 體感誘發電位（SEP）：刺激電極置于大鼠正中神經和脛后神經處，參考電極插入額部皮下，記錄電極插入兩耳連線中點［1-2］。刺激參數：強度2.0 mA、時程20 ms、頻率3.43 Hz、疊加次數300次。記錄各組大鼠損傷前、損傷后1 d、3 d、7 d及14 d體感誘發電位潛伏期及波幅的變化。運動誘發電位（MEP）：刺激電極置于大鼠顱頂冠狀縫前2 mm，矢狀縫旁2 mm皮下，記錄電極插入肱三頭肌和腓腸肌腹中部［1-2］。強度30 V，串數5個。記錄各組大鼠損傷前、損傷后1 d、3 d、7 d及14 d運動誘發電位潛伏期及波幅的變化。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0進行數據統計。計量資料符合正態分布的以均數±標準差（±s）表示，組間采用單因素方差分析，組內比較采用t檢驗。P〈0.05為差異有統計學意義。

圖1 簡易打擊器的制作和應用

2 結果

2.1 大鼠脊髓撞擊損傷組織HE染色

A組：神經元細胞呈三角形，尼氏體分散在胞質中，膠質細胞輪廓清楚，神經纖維排列整齊、緊密。B組：神經元細胞減少，但輪廓仍清楚，神經纖維排列稀疏，結構尚清。C組：神經元細胞稀少，輪廓欠清，可見空泡樣變性，神經纖維排列欠清。D組：神經元細胞更稀少，輪廓欠清，空泡樣變性增多，神經纖維排列不清。結果見圖2。

圖2 脊髓組織HE染色（×100）

2.2 大鼠脊髓撞擊損傷Tarlov評分

A組大鼠Tarlov評分在造模后1 d、3 d較造模前1 d降低，差異有統計學意義（P〈0.05），造模后7 d、14 d與造模前1 d比較差異無統計學意義（P〉0.05）；B組大鼠Tarlov評分在造模后1 d、3 d、7 d較造模前1 d降低，差異有統計學意義（P〈0.05），造模后14 d與造模前1 d比較差異無統計學意義（P〉0.05）；C組及D組大鼠Tarlov評分在造模后1 d、3 d、7 d、14 d均較造模前1 d降低，差異有統計學意義（P〈0.05）。結果見表1。

表1 各組大鼠不同觀測點Tarlov評分比較 ，±s（分 ）

表1 各組大鼠不同觀測點Tarlov評分比較 ，±s（分 ）

注：與本組造模前1 d比較，1）P〈0.05

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2.3 各組大鼠不同觀測點截癱例數比較

A組及B組造模后1 d分別有4只及7只大鼠截癱，造模后7 d無大鼠截癱；C組造模后1 d所有大鼠截癱，造模后14 d仍有5只大鼠截癱（P〈0.05）；D組造模后1 d大鼠均截癱，造模后14 d仍截癱。結果見表2。

表2 各組大鼠不同觀測點截癱例數比較 （例）

2.4 大鼠脊髓撞擊損傷神經電生理檢測

造模后電生理檢測中SEP、MEP潛伏期和波幅較造模前均有不同程度的改變，按A組至D組改變程度依次加大（P〈0.05）。A組大鼠在造模后14 d SEP、MEP潛伏期和波幅恢復至造模前水平；B組和C組造模后14 d SEP、MEP潛伏期和波幅均不能恢復至造模前水平（P〈0.05），且C組較B組恢復差（P〈0.05）。D組大鼠造模后各觀察點SEP、MEP潛伏期和波幅數值均為0。結果見表3～表6。

表3 各組大鼠不同觀測點SEP潛伏期測量結果比較（m s，±s）

表3 各組大鼠不同觀測點SEP潛伏期測量結果比較（m s，±s）

注：與本組造模前1 d比較，1）P〈0.05；與B組同一時間比較，2）P〈0.05

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表4 各組大鼠不同觀測點SEP波幅測量結果比較 （m V，±s）

表4 各組大鼠不同觀測點SEP波幅測量結果比較 （m V，±s）

注：與本組造模前1 d比較，1）P〈0.05；與B組同一時間比較，2）P〈0.05

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表5 各組大鼠不同觀測點MEP潛伏期測量結果比較 （m s，±s）

表5 各組大鼠不同觀測點MEP潛伏期測量結果比較 （m s，±s）

注：與本組造模前1 d比較，1）P〈0.05；與B組同一時間比較，2）P〈0.05

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表6 各組大鼠不同觀測點MEP波幅測量結果比較 （m V，±s）

表6 各組大鼠不同觀測點MEP波幅測量結果比較 （m V，±s）

注：與本組造模前1 d比較，1）P〈0.05；與B組同一時間比較，2）P〈0.05

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3 討論

Allen AR在1911年創造了通過垂直打擊脊髓制備脊髓損傷模型的方法。該法以一定力量撞擊脊髓后造成脊髓缺血、水腫及繼發的一系列反應，比較接近人類脊髓損傷的病理、生理及變化規律，臨床相關性好［3-6］。由于根據Allen′s法原理研制出的標準打擊器價格昂貴，在國內未能普及。本實驗基于經典Allen′s法原理制作簡易打擊器，并對使用該打擊器所制作的大鼠脊髓損傷模型進行評價。

簡易打擊器的制作及使用方法：1 mL醫用注射器的內徑為4.0 mm，將注射器頭端剪開制作成一個套管，在套管外側粘醫用膠布并標記刻度，起始刻度位于注射器尾端。測量直徑4.0 mm克氏針的總質量和總長度，截取質量為30 g的克氏針作為撞針。暴露好脊髓后將1 mm厚小墊片貼附在硬脊膜上，注射器套管的尾端垂直放在小墊片上（注射器尾端的翼有利于垂直放置套管）。克氏針順著套管從不同高度垂直打擊脊髓，從而完成脊髓打擊損傷模型的制作。

國內文獻報道大鼠脊髓打擊損傷模型研究中的打擊沖量多集中在20～100 g/cm［7-8］。因大鼠脊髓輕度損傷時具有較強的自愈性［9-10］，不利于觀察實驗干預情況，故本研究選取的打擊沖量為45～90 g/cm。本研究大鼠脊髓HE染色顯示隨著打擊沖量增加，組織學損傷程度加重：A組大鼠脊髓神經元細胞未見明顯減少、皺縮，神經纖維排列整齊；B組大鼠脊髓神經元細胞減少，神經纖維排列稀疏。C組大鼠脊髓神經元細胞稀少，可見空泡樣變性，神經纖維排列欠清。D組大鼠脊髓神經元細胞較C組更稀少，輪廓欠清，空泡增多，神經纖維排列不清。本實驗各組大鼠脊髓打擊損傷后均出現Tarlov評分下降，A組及B組大鼠造模后不能達到100%的截癱率，造模后Tarlov評分逐漸恢復，造模后7 d接近術前水平。C組大鼠造模后截癱率為100%，造模后Tarlov評分逐漸恢復，但造模后14 d仍恢復不到術前水平。D組大鼠脊髓打擊損傷后造成所有大鼠完全性癱瘓，造模后14 d仍無恢復。造模后除D組外電生理檢測中SEP、MEP潛伏期和波幅較造模前均有不同程度的改變，按A組至C組改變程度依次加大，A組大鼠在造模后14 d SEP、MEP潛伏期和波幅恢復至造模前水平；B組和C組造模后14 d SEP、MEP潛伏期和波幅不能恢復至造模前水平，且C組較B組恢復差。D組大鼠造模后各觀測點SEP、MEP潛伏期和波幅均無反應。

結果發現A組和B組能夠造成部分大鼠截癱，但在無治療干預情況下大鼠脊髓損傷可較好恢復，所以不利于觀察各種治療方法對大鼠脊髓損傷的干預效果；D組能夠造成所有大鼠截癱，但造模后各觀測點大鼠脊髓損傷無任何恢復跡象，脊髓損傷可能為不可逆損傷，故各種治療方法的干預可能對該組大鼠脊髓損傷恢復無效或者療效不顯著，不利于實驗觀察；C組采用75 g/cm打擊沖量造模能夠造成所有大鼠截癱，且造模后大鼠脊髓損傷有一定程度恢復，具有可逆性，更有利于觀察各種治療方法對大鼠脊髓損傷恢復的干預效果，故我們認為采用該方法制作大鼠脊髓損傷模型的打擊沖量選75 g/cm較為合適。

本研究采用簡易打擊器制作大鼠脊髓損傷模型（打擊沖量為75 g/cm）可造成所有大鼠截癱，模型可重復性高。其脊髓病理學表現、神經行為學評分及神經電生理檢測表明這種脊髓損傷具有可逆性，可作為理想的脊髓打擊傷治療研究的動物模型。