毛細管氣相色譜法測定巴胺磷溶液含量

楊 星，龔旭昊，馬秋冉，董玲玲，趙富華，彭文繡，于曉輝

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

巴胺磷是一種有機磷殺蟲藥，主要通過觸殺、胃毒起作用，不僅能滅殺家畜體表寄生蟲如螨、蜱，還能殺滅衛生害蟲如蚊、蠅等。市場上的制劑有巴胺磷溶液，主要用于驅殺綿羊體表螨、虱、蜱等[1]。巴胺磷溶液作為獸用制劑收載于《獸藥質量標準》(2017年版化學藥品卷)中，其含量測定方法為填充柱氣相色譜法[2]，在如今的檢測條件下方法適用性較差，給檢驗工作帶來較大困擾。目前國內外文獻主要采用氣相色譜-火焰光度檢測法、氣相色譜-氮磷檢測法、氣相色譜-串聯質譜法、超高效液相色譜-串聯質譜法等方法檢測蔬菜、大米、污水、水果、紡織品、豆粕中的巴胺磷殘留，針對巴胺磷溶液的含量測定方法的研究未見報道，各國藥典也未收載巴胺磷溶液質量標準[3-9]。為了更好地控制巴胺磷溶液的質量，參考氣相色譜法的相關文獻[10-11]，本研究擬建立毛細管氣相色譜-氫火焰離子化檢測法測定巴胺磷溶液含量的方法，以期為獸用制劑巴胺磷溶液含量的測定提供技術支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 氣相色譜儀：美國安捷倫公司，Agilent 7890A，配氫火焰離子化檢測器(FID)；電子分析天平：瑞士梅特勒-托利多集團， XS 205，精度0.01 mg。

1.2 試藥 巴胺磷對照品來源/批號/含量：農業部環境質量監督檢驗測試中心/GBW(E)081342/1000.0 μg/mL；鄰苯二甲酸二丁酯內標物質來源/批號/含量：上海源葉生物科技有限公司/A22D6L7951/99.8%；巴胺磷溶液規格/批號：40%/20190401、20190402、20190403；色譜級丙酮來源/批號：Fisher/182067。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Supelco SPB-624毛細管柱(固定相：6%氰丙基苯基-94%二甲基硅氧烷，規格：30 m×0.25 mm×1.4 μm，柱編號：24255)；柱溫：240 ℃；進樣口溫度：250 ℃；檢測器(FID)溫度：250 ℃；載氣：氮氣；流速：3 mL/min；進樣量：1 μL；分流比：15∶ 1。

2.2 溶液制備

2.2.1 內標溶液的制備 取鄰苯二甲酸二丁酯約30 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，用丙酮溶解并稀釋至刻度，搖勻(含內標0.6 mg/mL)。

2.2.2 供試品儲備液的制備 取供試品約125 mg(約相當于巴胺磷50 mg)，精密稱定，置50 mL量瓶中，用丙酮稀釋至刻度，搖勻(含巴胺磷1 mg/mL)。

2.2.3 對照品溶液的制備 精密量取1 mL巴胺磷對照品(含巴胺磷1 mg/mL)、1 mL內標溶液與2 mL丙酮，混勻(含巴胺磷0.25 mg/mL+內標0.15 mg/mL)。

2.2.4 供試品溶液的制備 精密量取1 mL供試品儲備液、1 mL內標溶液與2 mL丙酮，混勻(含巴胺磷0.25 mg/mL+內標0.15 mg/mL)。

2.2.5 系統適用性試驗溶液的制備 精密量取(0.8 mL巴胺磷對照品+2.2 mL丙酮、1 mL巴胺磷對照品+2 mL丙酮、1.2 mL巴胺磷對照品+1.8 mL丙酮)，分別與1 mL內標溶液混勻，制成相當于80%、100%和120%的對照品溶液。

2.2.6 線性溶液的制備 精密量取(0.1 mL巴胺磷對照品+2.9 mL丙酮、0.5 mL巴胺磷對照品+2.5 mL丙酮、0.8 mL巴胺磷對照品+2.2 mL丙酮、1 mL巴胺磷對照品+2 mL丙酮、1.2 mL巴胺磷對照品+1.8 mL丙酮、2 mL巴胺磷對照品+1 mL丙酮)，分別與1 mL內標溶液混勻，制成含巴胺磷分別為0.025、0.125、0.2、0.25、0.3、0.5 mg/mL的標準線性系列溶液。

2.2.7 回收率供試品溶液的制備 精密量取(0.5 mL供試品儲備液+0.3 mL巴胺磷對照品+2.2 mL丙酮、0.5 mL供試品儲備液+0.5 mL巴胺磷對照品+2 mL丙酮、0.5 mL供試品儲備液+0.7 mL巴胺磷對照品+1.8 mL丙酮)，分別與1 mL內標溶液混勻，制成相當于80%、100%、120%濃度水平的回收率供試品溶液，每種濃度各配制3份。

2.2.8 定量限溶液的制備 精密量取0.01 mL巴胺磷對照品+3 mL丙酮，與1 mL內標溶液混勻，制成巴胺磷色譜峰信噪比約為10的定量限溶液。

2.2.9 檢測限溶液的制備 精密量取4 μL巴胺磷對照品+3 mL丙酮，與1 mL內標溶液混勻，制成巴胺磷色譜峰信噪比約為3的檢測限溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性 分別精密量取丙酮、2.2.1項內標溶液、2.2.3項對照品溶液、2.2.4項供試品溶液各1 μL，照2.1項色譜條件測定。結果顯示，在該色譜條件下，巴胺磷主峰的理論板數大于31000，巴胺磷主峰與內標鄰苯二甲酸二丁酯主峰的分離度大于17.0，且與溶劑峰、輔料峰等其他色譜峰均能完全分離，巴胺磷的測定不受干擾，方法專屬性強(圖1)。

圖1 專屬性溶液色譜圖Fig 1 The chromatogram of solutions for specificity

2.3.2 線性關系考察 分別精密量取2.2.6項標準線性系列溶液各1 μL，照2.1項色譜條件測定。以巴胺磷峰面積與內標鄰苯二甲酸二丁酯峰面積的比值(y)為縱坐標，相應巴胺磷濃度(x)為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為y=3.8151x+0.0048，r2=0.9999，表明巴胺磷在0.025～0.5 mg/mL的濃度范圍內線性關系良好。

2.3.3 重復性試驗 精密量取2.2.5項80%、100%和120%的對照品溶液各1 μL，分別進樣2次，按內標法計算平均校正因子，RSD為0.6%；取1批巴胺磷溶液，平行制備6份供試品溶液進行測定，計算巴胺磷的含量，RSD為0.6%。結果表明，色譜系統和供試品測定的重復性均良好。

2.3.4 回收率試驗 采用加標回收率試驗測定準確度。分別精密量取2.2.7項回收率供試品溶液各1 μL，照2.1項色譜條件測定，采用內標法計算測定結果，結果見表1。

表1 巴胺磷添加回收率測定結果Tab 1 The results of the recovery rate ofadded propetamphos

2.3.5 定量限與檢測限 以巴胺磷峰信噪比S/N約為10和3的巴胺磷濃度作為定量限與檢測限，結果分別為2.5 μg/mL和1.0 μg/mL。

2.3.6 耐用性試驗 對該方法進行了流速±0.3 mL/min、柱溫±10 ℃、進樣口溫度±10 ℃、檢測器溫度±10 ℃、更換不同色譜柱等方面的耐用性考察，結果如表2所示，不同流速、柱溫、進樣口溫度、檢測器溫度、色譜柱的色譜條件下，巴胺磷理論板數均大于25000，巴胺磷與內標鄰苯二甲酸二丁酯分離度均大于15.0，方法耐用性良好。

表2 方法耐用性結果Tab 2 The results of robustness test

2.3.7 溶液穩定性試驗 取1份供試品溶液，室溫放置，分別于0、2、4、8、12、24 h后采集色譜圖，考察巴胺磷峰面積、鄰苯二甲酸二丁酯峰面積以及兩者峰面積比值的變化情況，RSD分別為1.9%、1.9%、0.2%。結果表明，由于采用丙酮作為溶劑，溶液容易揮發，隨著放置時間增加，巴胺磷峰面積和鄰苯二甲酸二丁酯峰面積逐漸增大，但24 h內兩峰面積的比值穩定，不會對測定結果造成干擾。

2.3.8 樣品測定 取3批供試品進行含量測定，含巴胺磷分別為標示量的97.3%、97.6%、97.1%，RSD分別為0.6%、0.4%、0.1%。

3 討論與結論

3.1 色譜柱 《獸藥質量標準》(2017年版化學藥品卷)中，巴胺磷溶液含量測定方法以非極性的100%甲基聚硅氧烷為固定相，本研究考察了與填充柱相同類型的SE-30毛細管柱、非極性的DB-1毛細管柱、強極性的HP-INNOWAX毛細管柱和中等級性的SPB-624毛細管柱。結果顯示，非極性的SE-30、DB-1毛細管柱巴胺磷峰與內標峰的峰型較差，強極性的HP-INNOWAX毛細管柱巴胺磷峰與內標峰不能完全基線分離，中等級性的SPB-624毛細管柱巴胺磷峰與內標峰的峰型對稱，兩者基線完全分離，適合于巴胺磷的含量測定。

3.2 柱溫 經考察，柱溫越高，巴胺磷和內標保留時間越小，測定耗時越短，同時巴胺磷峰與內標峰基線能完全分離，但為了避免過高的溫度對色譜柱填料造成損壞，柱溫不宜超過SPB-624毛細管柱的最大使用溫度250 ℃。

3.3 檢測器 目前氣相色譜用于巴胺磷殘留量測定的檢測器主要有火焰光度檢測器、氮磷檢測器和質譜檢測器，這些檢測器適用于樣品中痕量或微量分析，而巴胺磷溶液含量測定為常量分析，氫火焰離子化檢測器作為高靈敏度通用型檢測器，各實驗室配備率高，適用性更強。

3.4 內標法與外標法 采用丙酮作為溶劑，溶液容易揮發，隨著放置時間增加，巴胺磷峰面積和內標峰面積逐漸增大。采用外標法測定，測定結果的準確度和重復性容易受到干擾，采用內標法測定，巴胺磷峰與內標峰峰面積隨著溶劑揮發同比例變化，不會對測定結果造成干擾。

本研究建立了毛細管氣相色譜法測定巴胺磷溶液的含量，該方法操作簡便，具有專屬性強、快速準確、耐用性好等特點，對現有質量標準中填充柱氣相色譜法測定巴胺磷溶液含量進行了改善，適用于巴胺磷溶液含量的質量控制。