山蘭種子無菌繁殖研究進展

牟涵 李書翔 楊潔婷 黃碩 趙佳鑫 張忠寶

摘 要：本文從外植體的消毒、培養基的選擇、植物生長調節劑配方、種子萌發形態變化、防治褐化方法、外源添加物質等方面綜述了目前山蘭種子無菌繁殖的研究進展，并對未來山蘭組織培養技術進行分析與展望。

山蘭[Oreorchis patens（Lindl.）Lindl.]是蘭科山蘭屬多年生草本植物，分布于我國西南、華中、西北、東北各地，日本、朝鮮半島至西伯利亞也有分布，干燥球莖入藥，甘、辛、寒、有小毒，具有滋陰清肺、化痰止咳的功效，用于癰疳、瘡腫、瘰疬、無名腫毒[1]，亦作山慈菇入藥[2]。目前自然條件下的山蘭，只能利用其假磷球莖分生繁殖，繁殖系數低，每年只能分化出1～2子球[4]。難以滿足市場的需求，而有性繁殖至今沒有成功的報道。因此導致其商品價格上漲，野生資源遭到極大破壞。為實現山蘭的集約化、規模化生產，提高繁殖系數、降低生產成本，不少學者開展了山蘭組培繁殖的研究，為山蘭的生產繁殖和野生資源的保護提供了重要的理論基礎，具有重要的參考價值。

1 消毒方法

不同的外植體材料所選用的消毒方法和消毒時間不同。山蘭種子通常的消毒步驟：洗衣粉浸泡5～10min，蒴果置于流水下沖洗數小時，后至少利用兩種類型的消毒劑進行消毒、清洗。蒴果在清洗時應保證其完整性，破裂的蒴果不能作為實驗材料。張正海等在研究關于山蘭種子無菌萌發時[3]，流水浸泡蒴果8h，采用了75%的酒精和0.15%氯化汞組合進行蒴果的消毒處理，種子的萌發效果較好，污染低。在類似實驗研究中，為探究獨蒜蘭種子的最佳消毒組合時，李斌等[5]發現用75%的酒精和0.1%氯化汞組合消毒時，效果較佳，種子污染率低至26%。王躍華[8]等在關于杜鵑蘭種子快速萌發的研究中表明，杜鵑蘭0.1%升汞消毒最佳時間為6min，此時種子的染菌率低（15.6%），而存活率高（95.7%）。因此，結合其他的研究結果，山蘭種子消毒劑組合以升汞+酒精較好，較常見的組合消毒劑還有升汞+次氯酸鈉，同時山蘭種子消毒需要把握好時間，時間過長易導致種子死亡而無法萌發。

2 培養基的選擇

2.1 山蘭基礎培養基的選擇

培養基是外植體材料賴以生存和發展的營養基礎。不同種類、不同植物部位組織，對營養的要求都不盡相同，因此篩選合適的培養基，是植物組織培養極為重要的內容。目前山蘭組織培養最為常見的培養基為MS培養基。2015年張正海、張悅等[6]用MS、B5和White三種培養基，就含鹽量和高壓滅菌對培養基酸堿度的影響問題進行實驗研究，結果表明培養基酸堿度緩沖能力隨含鹽量增加而增加。山蘭種子的萌發需要長達60～70d的時間，故選擇無機鹽含量高且酸堿度緩沖能力強的MS培養基。

2017年張海正等[6]在探究MS培養基鹽含量對山蘭種子萌發的影響時，發現種子在MS、1/2MS培養基的萌發率顯著高于

1/4MS培養基，且MS、1/2MS培養基之間萌發數的差異不大。

2.2 山蘭種子在MS固體培養基與MS液體培養基培養的討論

張海正等[3]通過山蘭種子的組培實驗，詳細的記錄了山蘭種子萌發過程中形態變化的主要階段（從種子分化成胚細胞時開始詳細記錄）。先是種子包被在種皮內，種子胚細胞吸水膨脹。進而種子發育成心形胚，變成黃綠色，沖破種皮限制。隨后胚根開始分化根毛，分化出子葉和大量根毛，形成黃綠色的原球莖。后又分化成淺綠色的球莖。而白芨種子萌發時首先種胚吸水膨大，顏色轉綠，進而突破種皮形成原球莖，原球莖長出葉片和根，部分原球莖轉變為根狀莖，最后成苗[9]。總體上看，山蘭種子與白芨種子在萌發階段與形態上有相似性，故在培養基的選擇，可參照白芨的培養基類型。

趙垚[10]等在分析白芨種子于MS固體培養基、MS液體培養基兩種介質上萌發、生長的差異時發現，白芨種子用液體培養基培養時，長達60天也無法形成典型的真根，但種子的萌發率優于固體培養基，且有利于原球莖的增大。就MS的固體培養基而言，有真根的形成且根生長迅速。

綜上所述，山蘭種子可借鑒白芨的培養方案，在MS液體培養基中種子吸收營養水分，在短時間內得到大量原球莖，后及時將大量原球莖分裝至MS固體培養基可得試管苗，經煉苗、移栽最終形成大量山蘭幼苗。

3 植物生長調節劑

植物生長調節劑用量雖小，但培養基卻培養基在的關鍵性物質，是組織培養的“秘訣”。不同類型、不同配比關系、不同濃度的生長調節劑對植物生長不同時期的生長分化都起著決定性調

節作用。張海正等[3]發現山蘭種子適宜萌發培養基為MS+NAA 0.5mg/L+6-BA 2.0mg/L。且在此種條件下，山蘭的原球莖和橫走莖的發育誘導效果都不錯，而NAA含量降低利于原球莖分化，6-BA含量的增加利于橫走莖的分化。張海正等[7]發現，以MS培養基為基礎，分裂素TDZ、ZT、6-BA、KT作用于原球莖增殖時，6-BA效果相對較佳，且增殖效果有隨6-BA濃度增加呈先增大后降低的趨勢。生長素2，4-D、NAA、IBA、IAA作用于原球莖增殖時，NAA的增殖效果明顯。在6-BA 5mg/L+NAA 8.0mg/L組合時原球莖增值效果最佳;分裂素ZT、6-BA、KT作用于原球莖分化時，原球莖分化為球莖效果最佳的是KT，且分化系數有隨KT濃度增加呈先增大后降低的趨勢。生長素IBA、IAA作用于原球莖增殖時，IBA原球莖分化為球莖效果較好。在KT 2.5mg/L+IBA 2.5mg/L組合時原球莖分化效果最佳;在山蘭生根培養階段采用6-BA 0.1mg/L+IAA 2.5mg/L的組合，其生根效果較佳，達6.6條/球莖。

總結來看山蘭組培激素配比方案，可參照以下結果：

萌發培養為MS+NAA 0.5mg/L+6-BA 2.0mg/L

球莖增值培養為6-BA 5mg/L+NAA 8.0mg/L

原球莖分化培養為KT 2.5mg/L+IBA 2.5mg/L

生根培養為6-BA 0.1mg/L+IAA 2.5mg/L

4 討論與展望

目前關于山蘭的組織培養技術的研究中，關于植物生長調節劑及培養條件的分析比較常見，但就培養過程中防治污染、褐化及添加外源物質方面的資料較少。而親緣植物杜鵑蘭原球莖的抗褐化研究表明[15]，在五種抗褐化劑中，抗褐化效果依次為AC （300mg·L-1）>GSH（75mg·L-1）>Vc（50mg·L-1）>Na2S2O3（15 mg·L-1）>PVP（3000mg·L-1），此類研究，將對山蘭的組織培養中有一定的借鑒和啟示作用。

蘭科植物組培過程當中利用較多的外源添加物質常有蛋白質、馬鈴薯汁、椰乳和香蕉汁等。這些物質中含有一定量激素、氨基酸和維生素及其他營養物。研究發現，這類物質對植物的組織培養有顯著的促進作用。朱根發[11]等研究發現香蕉對酸堿有很強的緩沖能力，對植物的生長和增殖具有促進作用，山蘭種子萌發周期較長，可加入香蕉汁，起到酸堿緩存的作用;李斌等[5]研究發現，培養基中加入香蕉有助于獨蒜蘭種子萌發，二人的結論相符。石麗敏等[12]研究表明，蘭科種子萌發過程中不需要刻意加入外源物質，蘭科藥用植物種子萌發完全依賴內生真菌提供必要的碳源、氮源等多種營養物質。而在生根壯苗的過程中可加入一定的蔗糖以補充碳源，促進植物生長發育;孟肖[13]在培養基中添加番茄汁30g/L、馬鈴薯汁30g/L有助于白芨種子萌發并提高增殖率;李霖明[14]研究分析表明，椰汁含有某種特殊物質有助于誘導根莖出芽、提高胚的萌發率。因此在山蘭組織的萌發培養中可適當添加椰汁，促進胚的萌發。在分化、生根培養階段加入適量的蔗糖、馬鈴薯汁或番茄汁以補充氮源、微量元素等。此外在培養基在加入活性炭，可以有效吸附植物體的分泌物及一些有毒物質。此后的在山蘭組織培養研究中，可以進一步的去探尋有機物質在組織培養在中對植物萌發、增殖、分化、生長等方面的促進作用。

朱楨煜等[4]將山蘭球莖一分為二、一分為四進行組培繁殖，可以提高其繁殖系數。山蘭種子小、數量多，可以提供足夠的組培材料。對山蘭種子進行組培繁殖將有效的提高其繁殖系數、實現短期內獲取大量種苗的目標、為其規?；⒓s化生產提供技術條件。山蘭種子組培技術的進一步成熟，將有效的滿足市場需求，同時也將對野生資源的保護作出重要貢獻。

參考文獻

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