人血漿中安羅替尼質量濃度測定方法的建立及其應用

周利娟 武正華 汪碩聞 繆文清 包婺平 包愛華 范國榮

摘 要 目的：建立測定人血漿中安羅替尼質量濃度的方法并應用于臨床。方法：以醋酸銨為鹽析助劑，以乙腈為溶劑，采用鹽析輔助液液萃取對血漿樣品進行前處理;以伏立康唑為內標，采用液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）測定。色譜柱為Waters X Bridge C18，流動相為0.2%甲酸水溶液-乙腈（梯度洗脫），流速為1 mL/min，柱溫為40 ℃，進樣量為10 μL，分流比為3 ∶ 7;離子源為電噴霧離子源，以多反應監測模式進行正離子掃描，用于定量分析的離子對分別為m/z 408.3→339.3（安羅替尼）、m/z 350.2→281.3（內標）。結果：安羅替尼檢測質量濃度的線性范圍為0.2～200 ng/mL（R2=0.996 7）;定量下限為0.2 ng/mL;日內、日間精密度試驗的RSD均小于12%（n=6或n=3）;準確度為90.92%～108.00%（n=6或n=3）;平均提取回收率為87.51%～100.00%（RSD<8%，n=6）;平均基質效應為96.66%～99.93%（RSD<5%，n=6）。3例使用安羅替尼治療的非小細胞肺癌患者體內的血藥濃度為8.74～65.60 ng/mL。結論：該方法操作簡單、準確度高、專屬性強，可用于非小細胞癌患者體內安羅替尼的血藥濃度監測。

關鍵詞 安羅替尼;液相色譜-串聯質譜技術;鹽析輔助液液萃取;治療藥物監測

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish a method for concentration determination of anlotinib in human plasma and apply it in the clinic. METHODS： The plasma samples were pretreated by salting-out assisted with liquid-liquid extraction with ammonium acetate as salting out assistant and acetonitrile as solvent. Using voriconazole as internal standard， LC-MS/MS method was adopted. The separation was performed on Waters X Bridge C18 column with mobile phase consisting of 0.2% formic acid solution- acetonitrile （gradient elution） at the flow rate of 1 mL/min. The column temperature was set at 40 ℃， and sample size was 10 μL. The split ratio was 3 ∶ 7. The electrospray ion source and multiple reaction monitoring mode were used for the analysis. The ion pair of anlotinib and internal standard under positive ion mode were m/z 408.3→339.3 and m/z 350.2→281.3， respectively. RESULTS： Anlotinib showed a good linear relationship in the concentration range of 0.2-200 ng/mL （R2>0.996 7）. The lowest limit of quantitation was 0.2 ng/mL. Intra-day and inter-day RSDs were no more than 12% （n=6 or n=3）. Accuracies were 90.92%-108.00% （n=6 or n=3）. The average extraction recoveries were 87.51%-100.00%（RSD<8%，n=6）. The average matrix effects were 96.66%-99.93%（RSD<5%，n=6）. The plasma concentration of 3 patients with NSCLC treated with anlotinib was 8.74-65.60 ng/mL. CONCLUSIONS： The method is simple， accurate and specific， and is suitable for the plasma concentration monitoring of anlotinib in NSCLC patients.

KEYWORDS ? Anlotinib; LC-MS/MS; Salting-out assisted liquid-liquid extraction; Therapeutic drug monitoring

鹽酸安羅替尼是我國自主研發的一種新型口服酪氨酸激酶抑制劑，能夠有效抑制血管內皮生長因子受體、血小板衍生生長因子受體、纖維母細胞生長因子受體、干細胞因子受體（c-Kit）等激酶，具有抗腫瘤血管生成、抑制腫瘤生長的雙重作用[1-2]。基于ALTER 0303研究（安羅替尼治療晚期非小細胞肺癌患者的Ⅲ期臨床研究）的良好結果，國家食品藥品監督管理局于2018年5月8日正式批準安羅替尼單藥用于晚期非小細胞肺癌患者的三線及以上治療。有研究表明，安羅替尼的藥動學特征與其他酪氨酸激酶抑制劑類似，即經肝藥酶代謝，其血漿蛋白結合率較高、消除半衰期較長，長期連續使用后藥物在體內有明顯的蓄積，且個體間表現出較大的藥動學差異[3-4];此外，該藥在我國上市時間短，臨床用藥經驗有限，且其對細胞色素P450酶（包括CYP2D1、CYP3A1、CYP3A2）有顯著誘導作用，在長期使用過程中，可能與食物、配伍藥物發生相互作用[5]。關于安羅替尼致不良反應已經有大量文獻報道[6-7]，但目前尚未有研究探索安羅替尼血漿濃度與療效之間的相關性，且缺乏穩定、可靠的血藥濃度定量檢測方法。因此，為對腫瘤患者進行安羅替尼治療藥物監測（TDM）、為濃度-效應等相關性研究提供檢測技術支持、保證藥物使用的安全性和有效性，有必要建立相關的定量分析方法。

目前，關于安羅替尼的分析檢測方法，國內外文獻報道有限，且在現有的大多數安羅替尼療效及安全性評價研究中均未進行相關定量分析[3，8-10]，僅有少數國內學者建立了測定人血漿中安羅替尼濃度的液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS），并將其用于研究安羅替尼膠囊在我國成年腫瘤患者體內的藥動學特征[11]。該法雖然操作簡單，但由于血漿內源性物質較復雜，隨著進樣次數的增多會造成檢測系統壓力過高、分析重現性差、色譜柱損壞、靈敏度降低等現象，故應用受限[12]。Zhong等[3]在測定安羅替尼含量時，使用乙酸乙酯進行液液萃取，需要用氮氣流吹干并復溶，步驟繁瑣且耗時。鹽析輔助液液萃取是利用鹽析作用將水溶性有機溶劑（如乙腈）從血漿或水相中分離出來，可用于提取藥物和代謝物，尤其適用于親水性化合物的分析[13]。在進行鹽析輔助液液萃取時，僅需要向樣品中加入高濃度的鹽和水溶性有機試劑，經過渦旋離心后即可取上清液進樣分析，與傳統的液液萃取和固相萃取相比，不僅步驟少、耗時短，而且環保、經濟;與直接蛋白沉淀相比，可獲得基質成分更為單一的提取物[13]?；诖耍狙芯渴状谓⒘嘶邴}析輔助液液萃取聯合LC-MS/MS技術測定腫瘤患者血漿中安羅替尼濃度的方法，旨在為該藥的TDM及臨床個體化應用提供技術支持。

1 材料

1.1 主要儀器

本文所用主要儀器包括LC-20A型液相色譜系統及配備的LC-20AD型二元泵、DGU-20A3型脫氣機、SIL-20A型自動進樣器、CTO-20AC型柱溫箱（日本Shimadzu公司），API 4000型三重四極桿串聯質譜儀及配備的電噴霧電離源（ESI）和Analyst Software 1.6工作站（美國AB Sciex公司），SCILOGEX MX-S型渦旋混合器（美國Scilogex公司），Sorvall Legend Micro 21R型冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司），SK5200H型超聲儀（上海科導超聲儀器有限公司），TD4型低速臺式離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司），XS205 Dual Range型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司），Hi-Tech型水純化系統（上海和泰儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

本文所用主要藥品和試劑包括安羅替尼對照品（加拿大TRC公司，批號6-RTU-81-1，純度95%）、伏立康唑對照品（大連美侖生物技術有限公司，批號J1211AS，純度>99%）等;乙腈為色譜純，醋酸、甲酸等為分析純，水為自制的去離子超純水（18.2 MΩ）。

1.3 血漿樣品來源

1.3.1 空白血漿 選擇上海市第一人民醫院作體檢的健康體檢者，在其開展血常規等檢查時征得其知情同意后采集靜脈血。上述血樣經處理后作為空白血漿，用于定量分析的方法學考察。

1.3.2 患者血漿 患者血漿樣本由上海市第一人民醫院呼吸科提供，分別為3例使用安羅替尼的患者服藥前后的血漿樣品。患者的安羅替尼用藥劑量為12 mg/d，連續服用2周，停藥1周，即3周（21天）為1個療程。本研究已經通過了醫院醫學倫理委員會的批準（編號為2019-N-021），患者均已知情同意。

2 方法與結果

2.1 溶液的配制

2.1.1 貯備液 精密稱取安羅替尼對照品10.0 mg、伏立康唑（內標）對照品10.0 mg，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋成質量濃度均為1.0 mg/mL的安羅替尼貯備液和內標貯備液，于-40 ℃冰箱保存，備用。

2.1.2 工作液 將“2.1.1”項下安羅替尼貯備液用80%甲醇逐級稀釋，配制成安羅替尼質量濃度分別為4 000、2 000、400、80、40、8、4 ng/mL的系列工作溶液;同法配制安羅替尼質量濃度分別為3 200、160、8、4 ng/mL的系列質控工作液。將“2.1.1”項下伏立康唑貯備液用乙腈稀釋，配制成質量濃度為200 ng/mL的內標溶液。上述溶液均置于4 ℃冰箱中保存，備用。

2.1.3 標準曲線溶液和質控樣品溶液 精密量取“2.1.2”項下各系列工作液和質控工作液適量，用空白血漿稀釋20倍，制成安羅替尼質量濃度分別為200、100、20、4、2、0.4、0.2 ng/mL的標準曲線溶液和質量濃度分別為160、8、0.4、0.2 ng/mL的高、中、低質量濃度質控樣品溶液和定量下限（LLOQ）質量濃度血漿樣品溶液。

2.2 待測血漿樣品前處理

精密吸取待測血漿樣品50 μL，置于1.5 mL離心管中，加入內標溶液（200 ng/mL）5 μL，渦旋混勻;加入醋酸銨溶液（5 mol/L）50 μL，渦旋混勻1 min;加入乙腈100 μL，再渦旋混勻3 min，于4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，取上層清液進樣分析。

2.3 色譜條件與質譜條件

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Waters X Bridge C18（4.6 mm×100 mm，3.5 μm）;以0.2%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）為流動相進行梯度洗脫（0～0.5 min，20%B→80%B;0.5～3 min，80%B;3～3.1 min，80%B→20%B;3.1～5.0 min，20%B）;流速為1 mL/min;柱溫為40 ℃;進樣量為10 μL;柱后用三通3 ∶ 7分流，3/10進入質譜檢測。

2.3.2 質譜條件 離子源為ESI，檢測模式為正離子模式，選擇多反應監測方式（MRM）進行一/二級質譜檢測。氣簾氣為25 psi，碰撞氣為10 psi，霧化氣為50 psi，輔助氣為45 psi，噴霧電壓為5 500 V，離子源溫度為500 ℃;用于定量分析的離子對分別為m/z 408.3→339.3（安羅替尼，去簇電壓90 V，入口電壓10 V，碰撞電壓33 V，出口電壓15 V）、m/z 350.2→281.3（內標，去簇電壓90 V，入口電壓10 V，碰撞電壓27 V，出口電壓15 V），駐留時間均為200 ms。

2.4 專屬性考察

取空白血漿、空白血漿+安羅替尼（0.2 ng/mL）、患者3服藥前0.5 h的血漿樣品各適量，按“2.2”項下方法處理后，再按“2.3”項下條件進樣分析;同時，設置不加內標且同法處理的空白血漿為參照，考察方法的專屬性。結果，血漿樣品中安羅替尼和內標的保留時間分別約為2.4、2.8 min;色譜峰峰形良好，血漿樣品中的內源性物質和其他物質均不干擾安羅替尼和內標的測定，表明該方法專屬性較好。安羅替尼的典型MRM圖見圖1。

2.5 殘留評估

取“2.1.3”項下質量濃度為200 ng/mL的安羅替尼標準曲線溶液，按“2.2”項下方法處理后，再按“2.3”項下條件進樣分析;隨后，取空白血漿適量，按“2.2”項下方法處理后，再按“2.3”項下條件進樣分析以評估殘留。結果，在該分析條件下，血漿樣品中安羅替尼及內標伏立康唑均無殘留。

2.6 線性關系和定量下限考察

取“2.1.3”項下質量濃度分別為200、100、20、4、2、0.4、0.2 ng/mL的安羅替尼標準曲線溶液，按“2.2”項下方法處理后，再按“2.3”項下條件進樣分析，記錄峰面積。以安羅替尼的質量濃度（x）為橫坐標、安羅替尼與內標伏立康唑的峰面積比值（y）為縱坐標，采用最小加權二乘法以1/x2為權重因子進行標準曲線擬合，得安羅替尼回歸方程為y=0.081 8x+0.014 2（R2=0.996 7），其檢測質量濃度的線性范圍為0.2～200 ng/mL，定量下限為0.2 ng/mL。

2.7 精密度和準確度試驗

取“2.1.3”項下低、中、高質量濃度質控樣品溶液和定量下限質量濃度血漿樣品溶液適量，按“2.2”項下方法處理后，再按“2.3”項下條件連續進樣測定6次，考察日內精密度;連續測定3天，考察日間精密度。以實測質量濃度與理論質量濃度的比值來表示準確度。結果，安羅替尼各質量濃度樣品的日內RSD為0.81%～10.27%（n=6），日間RSD為3.91%～8.64%（n=3），準確度為90.92%～108.00%（n=6或n=3），表明該方法的精密度和準確度均良好，詳見表1。

2.8 提取回收率試驗

取“2.1.3”項下低、中、高質量濃度質控樣品溶液，各平行6份，按“2.2”項下方法處理后，再按“2.3”項下條件進樣分析，記錄待測成分峰面積（A1）;另取空白血漿，按“2.2”項下方法處理后，加入“2.1.2”項下低、中、高質量濃度質控工作液適量（使最終質量濃度與質控樣品溶液對應），按“2.3”項下條件進樣分析，記錄待測成分峰面積（A2）;按A1/A2×100%計算提取回收率。結果，安羅替尼各質量濃度樣品的平均提取回收率為87.51%～100.00%（RSD<8%，n=6），表明提取方法對樣品定量分析的影響較小，詳見表2。

2.9 基質效應試驗

分別取6份不同來源的空白血漿各50 μL，按“2.2”項下方法處理，取上清液，即得空白基質。向此空白基質中加入“2.1.2”項下低、高質量濃度質控工作液適量（使最終質量濃度與“2.7”項下低、高質量濃度質控樣品溶液對應），各平行6份，按“2.3”項下條件進樣分析，記錄待測成分峰面積（B1）。另取“2.1.2”項下低、高質量濃度質控工作液，用乙腈稀釋，制成與上述質量濃度對應的安羅替尼對照品溶液，各平行6份，按“2.3”項下條件進樣分析，記錄待測成分峰面積（B2）。以B1/B2×100%計算基質效應。結果，安羅替尼各質量濃度樣品的平均基質效應為96.66%～99.93%（RSD<5%，n=6），表明在該檢測條件下，基質對待測物定量分析的影響可以忽略，詳見表3。

2.10 穩定性考察

取“2.1.3”項下低、中、高質量濃度質控樣品溶液，各平行6份，考察其在室溫放置12 h、按“2.2”項下方法處理后在進樣器放置24 h、反復凍融3次（-40～24 ℃）和-40 ℃放置30天的穩定性。結果，安羅替尼各質量濃度質控樣品在上述條件下放置的準確度為88.83%～106.19%，RSD為2.60%～11.24%（n=6），表明各樣品在上述條件下穩定性良好。

2.11 非小細胞肺癌患者體內安羅替尼血藥濃度的檢測

采用上述鹽析輔助液液萃取結合LC-MS/MS技術檢測3例非小細胞肺癌患者體內安羅替尼的血藥濃度。其中，女性2例、男性1例，年齡56～62歲。本研究已通過醫院倫理委員會的批準，患者及家屬均知情且簽署知情同意書。取患者血漿樣品50 μL，平行2份，按“2.2”項下方法處理后，再按“2.3”項下條件進樣分析，記錄峰面積。根據當日隨行標準曲線計算血漿中安羅替尼的質量濃度，結果以平均值表示。其中，患者1為接受安羅替尼治療的第1個療程，抽血時間為該療程的第3天;患者2和患者3均為接受安羅替尼治療的第3個療程，抽血時間分別為該療程的第3天和第7天。結果，3例患者血藥濃度檢測結果與文獻[4]報道基本一致，詳見表4。

3 討論

3.1 LC-MS/MS 條件的優化

本研究前期考察了乙腈、甲醇作為有機相以及不同濃度甲酸水溶液作為水相對待測成分色譜峰峰形和響應值的影響。結果，當以乙腈作為有機相時，待測成分的響應值明顯高于以甲醇作為有機相時;在水相中加入甲酸可以提高安羅替尼的響應值，并可以使出峰時間提前;且當在水相中加入體積分數為0.2%的甲酸時，待測成分的色譜峰峰形較好且響應較強。

本課題組選取了兩種不同的色譜分析柱，分別是Waters X Bridge C18（100 mm×4.6 mm，3.5 μm）和Agilent Zorbax SB AQ（150 mm×4.6 mm，5 μm）。雖然Agilent Zorbax SB AQ也可以獲得較好的色譜峰峰形和響應值，但是所用分析時間較長，因此本研究選擇了峰形好且分析時間更短（共5 min）的Waters X Bridge C18作為分析柱。

此外，本課題組還考察了柱溫（25、30、35、40、45 ℃）對待測成分色譜峰峰形和響應值的影響。結果，當柱溫為40 ℃時，待測成分的響應值高且峰形好，故最終確定柱溫為40 ℃。

3.2 內標物的選擇

文獻中報道的酪氨酸激酶抑制劑的定量檢測方法大多以同位素作為內標，但是同位素價格昂貴且不易獲得[10-11]。伏立康唑是在腫瘤患者中較少使用的抗真菌藥物，不僅在本研究所建的檢測條件下與待測成分有相似的色譜行為，而且也不會與待測成分檢測通道產生串擾現象，因此本研究選擇伏立康唑作為內標。

3.3 血漿樣品前處理方法的選擇

關于小分子酪氨酸激酶抑制劑生物樣品的前處理方法，學者大多采用蛋白沉淀、液液萃取等[11，14]。但是血漿中含有大量的磷脂和蛋白質等雜質，若僅經簡單的蛋白沉淀處理，殘余的磷脂和蛋白會隨著進樣次數的增加而對色譜柱造成損傷，從而使檢測的靈敏度降低;然而以液液萃取作為生物樣品前處理方法，存在操作繁瑣、耗時長、人力和試劑消耗量較大等不足，其實際應用較為受限[13]。本研究基于醫院臨床監測樣本量大和時效性要求高等特點，采用鹽析輔助液液萃取的方法對血漿樣品進行前處理，該方法步驟和蛋白沉淀一樣簡單，僅需要在乙腈蛋白沉淀的基礎上向血漿樣品中加入5 mol/L的醋酸銨溶液，無需氮氣流吹干，僅通過渦旋離心便可獲得基質成分相對更為單一的樣品;同時，由于乙腈與血漿分相，既實現了對樣品的濃縮，又提高了檢測的靈敏度[13]。此外，本研究前處理過程中單個樣品的乙腈使用量僅為100 μL，相較于傳統的液液萃取減少了有機溶劑的使用量，故此法是一種經濟、環保的前處理方法。在鹽析助劑的選擇上，本研究選擇了醋酸銨。相較于氯化鈉等其他無機鹽，醋酸銨具有揮發性，對質譜的影響更小。同時，筆者在研究過程中發現，當醋酸銨溶液濃度為5 mol/L、體積為50 μL時，乙腈與血漿分層更加明顯，故最終確定了“2.2”項下的血漿樣品前處理方法。

3.4 方法建立的必要性及結果分析

酪氨酸激酶抑制劑口服給藥的方式使這類藥物的藥動學特征較為復雜。個體間藥動學及療效的差異易受到藥物靶點遺傳異質性、肝藥酶及轉運蛋白編碼基因多態性、患者治療依從性、配伍藥物相互作用等因素的影響，已經有多項研究發現酪氨酸激酶抑制劑血藥濃度與療效或毒性之間存在關聯[15-19]。

TDM可通過測定患者血漿中藥物的濃度，并將結果與臨床指南或目標水平進行比較，以實現個體化給藥，達到藥物療效與毒性之間的平衡[20]。2017年美國藥師協會對大量的臨床數據進行總結，匯編了《腫瘤治療中激酶抑制劑治療藥物監測實踐指南》，推動了酪氨酸激酶抑制劑TDM的臨床實踐[21]。

安羅替尼上市時間短，臨床用藥經驗不足，尚未有研究報道其血藥濃度與效應之間的關聯。雖然，其現有治療方案為服藥2周、停藥1周，抗腫瘤效果好且毒性可控，但長期安全性及療效數據有限[4]。本研究將所建方法應用于3例服用安羅替尼患者的血藥濃度的檢測，同時在其治療過程中均未發現相關不良反應的發生。由于安羅替尼為非小細胞肺癌患者的三線用藥方案，臨床使用時間較短，因此本課題組收集到的臨床樣本量有限，加之抽血時間點不一致，故無法評價藥物的效果并明確其有效治療窗。因此，未來尚需進一步進行試驗設計及實踐，收集一定量的患者樣本后，進行血藥濃度-效果關聯性分析，為今后安羅替尼的TDM提供依據。

4 結語

綜上所述，本研究建立了基于鹽析輔助液液萃取結合LC-MS/MS技術測定腫瘤患者血漿中安羅替尼濃度的分析方法;該方法所用血漿量少，不僅操作簡單，還可以獲得成分相對的單一的基質，且靈敏度高、精密度和準確度良好、專屬性強，符合生物樣品中藥物定量分析方法學驗證的基本要求[22]，可用于臨床開展安羅替尼的TDM。

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（收稿日期：2021-01-11 修回日期：2021-04-08）

（編輯：張元媛）