1株羊乳房炎源大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性分析

喬雙梅

青海省大通縣景陽鎮崗沖畜牧獸醫站，青海大通810105

羊乳房炎是一種多發性疾病，主要表現為患病母羊乳房潮紅、發熱、腫硬和疼痛，嚴重影響母羊的泌乳性能。臨床上，最常見致病原因是多種病原菌侵入母羊乳房內部引起乳房炎，而在羊乳房炎病原菌總數中，鏈球菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌這3種病原菌所占比例最高。本試驗對1 株羊乳房炎源大腸桿菌進行分離鑒定，同時采用紙片法對該菌株進行藥物敏感試驗，以期為該地區羊臨床型乳房炎的預防和治療提供有益參考和依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1）病料來源。采自青海省大通縣景陽鎮某羊場的臨床型乳房炎患羊乳樣。采集時先消毒乳頭，將前5～10 mL 羊乳棄掉后無菌操作取乳樣。

2）主要試劑、儀器設備和試驗動物。鮮血瓊脂培養基、麥康凱培養基、營養肉湯培養基、伊紅美蘭、細菌微量生化反應管、革蘭氏染液；12 種抗菌藥物紙片；恒溫培養箱、光學顯微鏡、游標卡尺；SPF 小白鼠6 只，雌雄各3 只，18～20 g/只。

1.2 試驗方法

1）菌株的分離培養。將采集的乳樣接種在鮮血瓊脂培養基（50 mL/L）上，37 ℃恒溫培養箱中培養24 h 后察看細菌生長情況，將菌落接種于麥康凱培養基上繼續純化培養，選擇典型單菌落涂片、革蘭氏染色和鏡檢，觀察菌體形態、染色特性，再將單菌落接種在伊紅美蘭培養基培養和鑒定，同時接種到鮮血瓊脂平板，察看其溶血現象。

2）生化鑒定。采用細菌微量生化反應管并參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》，實施生化鑒定和生化培養，將疑似大腸桿菌的菌株接種到各細菌微量生化反應管中，在37 ℃條件下培養48 h 后觀察試驗結果。

3）小鼠致病性試驗。6 只小白鼠分為試驗組和對照組，每組3 只，將分離純化并鑒定的大腸桿菌純培養物接種到營養肉湯培養24 h 后，試驗組、對照組小白鼠分別注射菌懸液（0.5 mL/只）和生理鹽水，注射后的兩組小白鼠隔離飼養，并觀察其存活情況，及時解剖死亡小白鼠，觀察剖檢病理變化，無菌采集死亡小白鼠脾和肝等組織進行細菌分離鑒定。

4）耐藥性試驗。通過K-B 紙片擴散法對已鑒定過的菌株進行藥物敏感試驗，試驗方法參照《獸醫微生物學》[1]，參考美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）推薦的紙片擴散標準，用游標卡尺測量藥敏紙片的抑菌圈直徑，并根據抑菌圈的大小判定其對抗菌藥的耐受程度。

2 結果與分析

2.1 分離菌株形態特征及染色特性

分離菌株在麥康凱培養基和伊紅美蘭培養基上分別形成粉紅色和墨綠色（帶有金屬光澤）菌落，菌落均隆起、光滑呈圓形；分離菌株不溶血；對分離菌株染色鏡檢可見兩端鈍圓的革蘭氏陰性、紅色短桿菌，無芽孢，疑似大腸桿菌的菌株。

2.2 分離菌株的生化特性

分離菌株的生化鑒定結果見表1。分離菌株發酵麥芽糖、葡萄糖、甘露醇和乳糖，能產酸又產氣（“⊕”表示產酸產氣）；吲哚試驗、MR 試驗為陽性（“+”表示陽性反應），枸櫞酸鹽試驗、V-P 試驗為陰性（“-”表示陰性反應），該試驗結果與大腸桿菌的生化鑒定相符合，判定分離菌株為大腸桿菌。

表1 分離菌株的生化鑒定結果

2.3 小鼠致死試驗結果

注射菌懸液的3 只試驗組小鼠于24 h 內全部死亡，注射生理鹽水的3 只對照組小鼠無死亡，剖檢死亡小鼠可見腸內充盈水樣內容物呈黃色，腸壁變薄，十二指腸膨脹呈半透明狀，內臟器官無顯著病變；從死亡小鼠臟器中分離得到與接種菌株一致的大腸桿菌，可知本試驗分離出的大腸桿菌致病性極強。

2.4 耐藥性試驗結果

大腸桿菌對抗菌藥物耐藥性試驗結果見表2。藥敏試驗結果顯示，本次臨床型乳房炎患羊的乳樣中分離鑒定得到的該株大腸桿菌對頭孢唑林、新霉素、慶大霉素和卡那霉素高度敏感（“S”表示高度敏感），對諾氟沙星、頭孢氨芐、四環素中度敏感（“I”表示中度敏感），對阿莫西林、羅紅霉素、萬古霉素、青霉素G、鏈霉素表現出耐藥性（“R”表示耐藥）。

表2 分離菌株藥敏試驗結果

3 小 結

1）本試驗通過對青海省大通縣景陽鎮某羊場的臨床型乳房炎患羊的乳樣進行分離培養、生化鑒定得到1 株大腸桿菌，通過對分離鑒定的大腸桿菌進行小鼠致病性試驗，可知該株大腸桿菌致病性極強，并且大腸桿菌是導致當地羊臨床型乳房炎的優勢病原菌。

2）對分離鑒定得到的大腸桿菌進行藥物敏感試驗，結果顯示大腸桿菌對多種常用抗生素產生耐藥性，這與當地牧民長期頻繁濫用、亂用以及大劑量使用抗菌藥密切相關，加大了羊乳房炎臨床治療難度，為此相關部門應采取有效措施，加強抗菌藥物的規范使用和管理。

3）在養羊生產中，應堅持防重于治的原則，加強對牧民群眾科學養殖知識的普及和用藥指導，改善飼養條件，提高羊群免疫力，同時要定期檢測隱性乳房炎，做到早發現早治療，目前針對羊乳房炎可運用中醫藥治療[2]，不僅成本低，方法多樣，而且能夠避免乳內抗生素殘留，達到良好的治療效果。