兔坐骨神經急性擠壓傷模型的建立及擴散峰度成像的b值優選

梁曉韻，萬 齊，余煜棟，彭 玉，陳智杰，李新春廣州醫科大學附屬中醫醫院放射科，廣東 廣州 50000；廣州醫科大學附屬第一醫院放射科，廣東 廣州500

周圍神經損傷是導致嚴重運動障礙的重要健康問題［1］。由于人體研究病理取材的限制，動物模型的建立對周圍神經損傷修復的研究具有重要意義。目前周圍神經擠壓傷動物模型的制作方法多種［2］，其中用于MRI評估的周圍神經擠壓傷動物模型亦不少，但現有的擠壓傷模型損傷段神經多較短，使用MRI監測時只能評估擠壓傷遠端的神經改變，而未能直接反映擠壓段的磁共振信號變化［3］。本研究嘗試使用自制扁嘴鉗，模擬人體周圍神經損傷機制，以期制作適合MRI直接監測的兔坐骨神經急性擠壓傷模型。擴散峰度成像（DKI）是反映組織內非高斯分布水分子擴散情況的功能成像方法，在中樞神經系統已有較多地應用研究，但在周圍神經創傷評估方面研究尚少［4-5］。在中樞系統中，DKI的最高b值至少需要2000 s/mm2，而在體部應用則至少需要1500 s/mm2［6］；然而哪個b值組合更適合于周圍神經成像目前尚未見報道。本研究擬基于建立的動物模型，對周圍神經DKI成像b值的優選進行探討，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用健康新西蘭大白兔27只（清潔級，由廣東省動物實驗中心提供），雌雄不限，體質量1.8～2.3 kg。選取右后肢作為損傷側，建立坐骨神經損傷與修復模型，左側為假手術側。實驗方案經廣州醫科大學動物實驗倫理委員會批準。

1.2 模型制作

速眠新肌注誘導麻醉后，經耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉麻醉，常規消毒備皮。右側為實驗側，左側為對照側。實驗兔取左側臥位，在無菌操作下于右側大腿上段沿股骨背側長軸縱向切口約2 cm，鈍性分離股二頭肌與股直肌及內收長肌間隙，暴露坐骨神經，速眠新滴注于神經上局部麻醉，合上血管鉗輕輕提起坐骨神經遠端，用自制扁嘴鉗，鉗嘴寬約8 mm，夾持坐骨神經30 s，鉗夾力約54 N，可見神經纖細變薄但未離斷，然后以絲線分層縫合切口。左側大腿相同部位行假手術，以相同方式暴露坐骨神經并滴注速眠新局部麻醉后直接縫合創口（圖1）。

圖1 兔坐骨神經急性擠壓傷模型制作Fig.1 Establishment of rabbit model of acute sciatic nerve crush injury.

1.3 磁共振掃描

采用超導型3.0 T TX 多源磁共振設備（Philips，Achieva）及兔專用線圈，分別于術前、1 d、3 d、1周、2周、4周、6周、8周行MRI掃描，觀察損傷段神經及周圍肌肉的信號改變。掃描序列包括：T2WI/SPAIR：TR 3000 ms，TE 66 ms，NSA=2，層厚2 mm，采集矩陣172×137，重建矩陣528×528，FOV 120×120。DKI1500：TR 1158 ms，TE 115 ms。層厚/層間距：2 mm/0 mm，b=0、750、1500 s/mm2，擴散編碼方向medium（15方向），FOV 120 mm×120 mm，采集矩陣80×79，體素1.4 mm×1.4 mm。DKI2000：b=0、1000、2000 s/mm2，余成像參數與DKI1500一致。

1.4 病理檢查

于各時間點隨機選取2只兔子，使用過量麻醉將兔處死并解剖兔的下肢。兔取側臥位雙大腿屈曲，取股骨下橫向切口為入口，沿肌間隙鈍性分離，暴露、游離坐骨神經，取損傷段神經一段立即置于4%戊二醛磷酸緩沖液中預固定，l%四氧化鋨后固定，系列乙醇脫水，Epon812環氧樹脂包埋，LKB-Ⅲ型超薄切片機切半薄切片定位，再切超薄切片，片厚50 nm，經醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色后，用Hitachi H-600電子顯微鏡觀察。

1.5 統計學分析

采用SPSS19.0對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用重復測量資料的單因素方差分析方法，分析損傷側與對照側神經各時間點DKI參數。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 坐骨神經擠壓傷后神經大體觀察

損傷后1 d，神經損傷段變扁，扭曲，彈性減低，神經表面充血，損傷后3 d～2周，神經損傷段不同程度腫脹，與鄰近肌肉黏連，神經表面淤血逐漸減少。損傷后4～8周，神經損傷段仍腫脹，程度稍減輕，與鄰近肌肉不同程度黏連。

2.2 電鏡改變

正常神經髓鞘結構完整，髓鞘呈層板狀，軸索排列整齊，走行平直、分布均勻。損傷后第1天、第3天，有髓神經呈脫髓鞘狀的洋蔥皮樣改變，軸索輕度萎縮，可見大量神經微絲，線粒體腫脹、空化。施萬細胞胞質可見溶酶體，同時可見大量自噬體形成，可見核染色質凝集、邊集。損傷后第1周、第2周，有髓神經結構較前改善，髓鞘輕度皺縮，軸索可見大量神經微絲，部分軸索輕度萎縮，可見少量蜂窩狀結構形成，周圍見少量新生薄髓神經。損傷后第4周，軸索開始增生,雪旺細胞開始增生，并可見神經外膜與神經束膜之間炎癥細胞浸潤減少。損傷后第6周，髓鞘逐漸增厚,髓鞘菲薄且不均勻，再生軸索較前明顯并成熟，雪旺細胞廣泛增生，板層結構稍紊亂，周圍大量新生薄髓纖維。損傷后第8周，軸索密度、直徑較前增加，髓鞘明顯較前增厚，板層結構逐漸恢復接近正常，厚薄欠均勻。

2.3 DKI1500及DKI2000各參數值變化

DKI2000與DKI1500在各參數的總體變化趨勢基本一致。FA值（圖2）：損傷后第1天損傷側和假手術側坐骨神經FA值明顯下降，以損傷側明顯；損傷后第3天～第8周持續上升，其中假手術側的FA值上升較損傷側快，FA1500及FA2000于各時間點的組間差異均有統計學差異（P=0.001、0.004、<0.001；P=0.001、<0.001，表1）。

圖2 損傷前后兔坐骨神經DKI2000序列FA圖Fig.2 Rabbit sciatic nerve on FA map of DKI2000 before and after crush injury.

表1 DKI2000與DKI1500序列坐骨神經FA值比較Tab.1 Comparison of FA values between DKI2000 and DKI1500（Mean±SD）

雙側神經MK值在第1天均明顯下降，此后開始緩慢、曲折上升的趨勢，雙側MK1500值在術后第2周（P=0.022）、第4周（P=0.018）、第6周（P=0.016）及第8周（P=0.016）差異有統計學意義。而MK2000僅在第4周組間差異有統計學意義（P=0.002，表2）。

表2 DKI2000與DKI1500序列坐骨神經MK值比較Tab.2 Comparison of MK values between DKI2000 and DKI1500（Mean±SD）

RK值在第1天明顯下降，其后各時間點RK值波動較大，RK1500與RK2000均在第6周雙側神經組間差異具有統計學意義（P=0.018、0.039，表3）。AK值雙側神經于各時間點組間差異均無統計學意義（P>0.05，表4）。

表3 DKI2000與DKI1500序列坐骨神經RK值比較Tab.3 Comparison of RK values between DKI2000 and DKI1500（Mean±SD）

表4 DKI2000與DKI1500序列坐骨神經AK值比較Tab.4 Comparison of AK values between DKI2000 and DKI1500（Mean±SD）

3 討論

周圍神經擠壓傷動物模型的制作方法較多，以鉗夾方式較為多見［2］；但若使所制作的模型適合MRI監測，則需要損傷段的神經具有一定的長度［7］。有研究利用無齒微血管鉗制作兔坐骨神經急性擠壓傷模型進行MRI研究［8］，但由于損傷段神經較短，只能對損傷段遠端神經進行MRI定量監測。也有學者使用絲線結扎坐骨神經制作擠壓傷，損傷段神經仍然較短，故MRI只能監測損傷段遠端神經［9］；Sun等［3］用有齒持針鉗鉗至一扣約3.6 kg鉗夾，鉗夾范圍約3 mm，但仍不足以滿足MRI監測的需要，而只能對損傷段以遠神經進行評估；Luis等［10］采用自制的無齒鉗制作擠壓大鼠坐骨神經擠壓傷模型進行形態及功能的研究，其產生的鉗夾力恒定為54 N，鉗夾范圍寬約3 mm。李登科等［11］用螺旋測微儀卡口擠壓坐骨神經，擠壓神經厚度至0.15 cm，停留時間為60 s，坐骨神經損傷長度為5 mm。此模型損傷段較寬，但因其螺旋桿在對神經進行擠壓的同時容易引起坐骨神經扭轉，額外增加橫向旋轉的剪切力，導致神經牽拉傷或拉斷神經纖維。針對以上問題，本研究采用較寬的扁嘴鉗擠壓裝置，擠壓傷段神經長度約1 cm，制作坐骨神經急性擠壓傷模型。鉗夾后肉眼可見鉗夾處神經明顯變薄呈半透明狀，經病理檢查證實損傷段神經發生wallerian變性，髓鞘及軸突崩解，表明本研究成功制作了坐骨神經擠壓傷模型。

本實驗在第4周時可見新生軸索形成，與既往文獻略有不同，考慮為損傷的嚴重程度及病理取材部位不同所致。有學者制作的大鼠坐骨神經擠壓傷模型分別在術后2周和3周即出現軸索再生［9,12］，可能是由于所用裝置鉗夾力較小及鉗夾范圍較短，故神經再生時間相對較早；Sun等［3］制作的兔坐骨神經擠壓傷模型在術后第6周出現軸索再生，這可能是由于其使用有齒鉗制作模型，造成的神經損傷更為明顯，且病理取材部位為神經損傷遠端所致。

既往周圍神經損傷成像評估以DTI多見［13］；DKI在周圍神經損傷應用較少，且多以視、聽神經為主［14］。本研究嘗試使用最高b值為1500 s/mm2及2000 s/mm2的不同組合對坐骨神經進行DKI 成像，發現DKI1500與DKI2000各參數的變化趨勢相似；損傷后FA值降低可能與神經局部炎性反應及水腫，導致周圍神經水分子擴散各向異性降低相關，FA值升高可能與損傷后的微絲、微管、施萬細胞的增殖、水腫消退及神經再生導致神經各向異性增高有關；這與之前DTI評估周圍神經損傷的研究［15-16］類似。MK值術后第1天下降，此后開始緩慢、曲折上升；DKI1500中損傷側與假手術側MK值在第2～8周時差異有統計學意義，而DKI2000序列中兩側MK值僅在第2周時差異有統計學意義，說明DKI1500可能更適于周圍神經成像評估。另一方面，DKI1500與DKI2000兩個序列的RK值、AK值在各時間的組間差異無統計學意義，且各組數據標準差較大，這可能是由于DKI序列中應用的最高b值較大時高b值彌散圖像的噪音對參數計算產生影響［17］；且兔坐骨神經較為細小，對噪聲的影響較為敏感所致。b值越大，圖像的信噪比越差，從這個角度來說，DKI1500由于使用更小的b值，也更適合于周圍神經的成像與評估。

綜上所述，本研究利用自制扁嘴鉗擠壓裝置，成功制作坐骨神經急性擠壓傷模型。本模型便于使用MRI對神經損傷與再生進行動態監測，同時也方便使用定量MRI技術對擠壓傷段神經進行直接測量。DKI可用于周圍神經的評估，DKI周圍神經成像最大b值取1500 s/mm2可能較2000 s/mm2更為合適。