大豆肽酶解條件與抗氧化性關(guān)系的研究

溫 睿

（牡丹江大學醫(yī)護學院，黑龍江 牡丹江 157011）

自由基在人體產(chǎn)生過多或清除過慢時，其通過攻擊生命大分子物質(zhì)和各種細胞，加速機體衰老并誘發(fā)多種疾病。[1]獲取天然、安全、高效的抗氧化劑成為當前研究的熱點。[2]大豆肽是大豆蛋白的水解產(chǎn)物。大豆肽的氨基酸組成幾乎與大豆蛋白質(zhì)的相同，必需氨基酸模式平衡良好、含量豐富。大豆肽具有多種生理活性。本研究采用二苯代苦味酰基自由基消除率測定方法，固定大豆肽酶解條件中四種因素變化其中一種因素來研究其酶解條件與抗氧化性的關(guān)系，為大豆肽的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

大豆；Alcalase堿性蛋白酶；二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）；氫氧化鈉；鹽酸；硫酸；硫酸鉀；硫酸銅；三氯乙酸；福林-酚試劑。

1.1.2 儀器與設(shè)備

微電腦電磁爐；電子分析天平；遠紅外分析儀；722型分光光度計；快速混合器；雙螺桿擠壓機；高速萬能粉碎機；恒溫水浴鍋；JJ-1增力電動攪拌器；酸度計；離心機； 蛋白質(zhì)測定儀。

1.2 試驗方法

1.2.1 大豆肽的制備

采用酶法制備大豆肽。[3]市售大豆先經(jīng)擠壓膨化，再粉碎，然后準確稱取豆粉50g。稱取適量的水，加入豆粉中，配制成一定濃度的料水比溶液，置于恒溫水浴鍋中開始攪拌，調(diào)節(jié)溫度，調(diào)節(jié)pH值，加入適量的Alcalase堿性蛋白酶進行恒溫酶解，在此過程中需要不斷進行攪拌，同時需用1N的氫氧化鈉溶液通過滴加來維持反應(yīng)體系pH值的恒定（偏差控制在±0.1）。達到設(shè)定酶解時間后，取出酶解液在4500r/min的離心機中離心20min。離心后，將頂層漂浮油脂小心傾倒撇去，收集中層清液，在中層清夜中滴加10%三氯乙酸調(diào)節(jié)其pH至4.3（大豆蛋白等電點），然后將酶解液放入沸水浴，水浴10min使酶活力喪失，在4500r/min低溫離心機中離心20min，傾倒出上清液，除去底層沉淀物，即未水解大豆蛋白和其它非溶性物質(zhì)，記錄上清液總體積，將其裝入塑料小瓶中置于4℃冷藏保存。取部分上清液測蛋白質(zhì)含量，利用公式（2）計算TCA-NSI值；記錄NaOH溶液的滴加量，利用公式（1）pH-stat法計算水解度。

（1）VNaOH—消耗堿液的體積（ml）；

NNaOH—消耗堿液的的摩爾濃度（mol/L）；

α-為α-氨 基 解 離 度，1/α=l+l0(pH-pK)，其中pK為α-氨基的平均pK， pH為反應(yīng)起始的pH值；

Mp—底物蛋白質(zhì)的總量（g）

Htot—單位質(zhì)量蛋白中的肽鍵總和（mmol/g），對于某一特定的蛋白質(zhì)來講Htot是一個常數(shù)，大豆蛋白Htot=7.75mmol/g。

大豆肽的計算公式

取酶解上清液，加入等量的10%的三氯乙酸（TCA）溶液，混合震蕩30min，然后離心分離20min（4500rpm），測上清液可溶性氮，計算氮溶指數(shù)，也是肽得率。

（2）TCA-NSI—三氯乙酸可溶性氮得率（%）；

N1—在10% TCA中可溶性氮（mg）；

N2—樣品中總的氮含量（mg）。

1.2.2 大豆肽對二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）清除能力的測定方法[4]

DPPH·是一種以氮為中心的很穩(wěn)定的自由基，其乙醇溶液為深紫色，它在可見光區(qū)最大吸收峰為517nm。在DPPH溶液中加入抗氧化劑時，其顏色變淺，變淺程度與抗氧化劑對自由基的清除能力呈線性關(guān)系。因此可用于評價天然抗氧化劑清除自由基的能力。[5]

準確取大豆肽酶水解物1.00mL，加入4.00mL的100μmol/L DPPH乙醇溶液混勻，避光放置30min，以原溶劑調(diào)零，在517nm處測定吸光度記為Ai；同法取1.00mL溶劑加入4.00mLDPPH溶液混勻，測定吸光度記為Ac；取1.00mL水解物加入4.00mL的溶劑混勻，測定吸光度記為Aj。計算公式為：自由基清除率=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100% 。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆肽酶解條件與抗氧化性的關(guān)系

2.1.1 大豆肽對二苯代苦味酰基自由基消除率與水解時間的關(guān)系

在溫度57℃，酶解時間4h，料水比1/6，pH9.5的酶解條件下，變化酶解時間為1.5h、2.5 h、3.5 h、4.5 h、5.5h， 研究自由基消除率與酶解時間的關(guān)系。

圖1顯示：隨著酶解時間的延長，肽得率和大豆肽對自由基的清除率都升高，大豆肽對自由基的清除率在4.5h時達到最高33.09%，超過4.5h后呈下降趨勢。

圖1 二苯代苦味酰基自由基消除率和肽得率隨水解時間變化曲線Fig1 Time of hydrolysis affects on the capability of acyl-diphenyl bitter scavenging rate and peptide yield

由圖1可知，抗氧化性和肽得率在水解前期變化比較一致，隨著水解時間的增加，抗氧化活性不斷的提高，達到最高值后，繼續(xù)延長水解時間，大豆肽抗氧化活性逐漸降低，而肽得率在抗氧化活性達到最高值后稍有升高。原因可能是蛋白酶是逐步水解蛋白質(zhì)的，當?shù)鞍酌噶亢偷孜镆欢ǖ那闆r下，蛋白質(zhì)通常被逐步水解為較小的肽段，而具有強自由基消除率的肽段一般是具有特定氨基酸殘基的，隨著水解時間的延續(xù)，具有強自由基消除率的肽段可能將被從蛋白質(zhì)序列上水解下來，然后進一步水解為氨基酸，而導致部分抗氧化活性消失。

2.1.2 大豆肽對二苯代苦味酰基自由基消除率與加酶量的關(guān)系

在溫度57℃，酶解時間4h，料水比1/6，pH9.5的酶解條件下，變化加酶量（U/g）4800、9600、14400、19200和24000，研究自由基消除率與加酶量的關(guān)系。

圖2顯示：隨著酶用量的加大，肽得率和自由基消除率均呈先上升趨勢，當酶用量達19200U/g時對自由基的清除率最高，效果最優(yōu)。而肽得率在抗氧化性達到最高值后稍有增加。隨著加酶量的增加，水解度不斷提高，蛋白酶的濃度決定底物的水解度，只有當酶分子在該體系中趨于或者達到飽和后，部分酶分子不能再與底物接觸時，水解度變化趨勢趨于降低。隨著加酶量的增加，大豆肽的肽得率也隨著增加，水解物的分子量的分布范圍就會越小，而水解物只有在一定的分子量范圍時才表現(xiàn)較高的抗氧化活性，水解不足或過度水解等都使其水解物的抗氧化活性降低。

圖2 自由基消除率和肽得率隨加酶量變化曲線Fig2 The contents of protease affects on the elimination rate of free radicals and peptide yield

2.1.3 大豆肽對二苯代苦味酰基自由基消除率與pH值的關(guān)系

在溫度57℃，酶解時間4h，料水比1/6，加酶量1.7%的酶解條件下，變化pH值7.5、8、8.5、9、9.5、10，研究自由基消除率與pH值的關(guān)系。

由圖3可知：隨著水解液pH值的增大，肽得率和自由基消除率都呈上升趨勢，當pH值達到9.0時，肽得率和自由基消除率達到最大值，接著隨著pH值的升高而降低。在pH值為9.0時，對自由基的清除率在達到最高為33.85%，效果最優(yōu)。酶蛋白發(fā)揮其催化效能需要保持一定的空間構(gòu)象，大豆的解離狀態(tài)隨pH值的變化而變化。這些變化也影響了酶分子的特殊構(gòu)象。大豆蛋白作為反應(yīng)體系中的底物隨pH的變化也呈現(xiàn)出不同的解離狀態(tài)。所以pH值能直接影響酶與蛋白底物的結(jié)合以及催化。

圖3 自由基消除率和肽得率隨pH值變化曲線Fig3. The pH affects on the elimination rate of free radicals and peptide yield

2.1.4 大豆肽對二苯代苦味酰基自由基消除率與溫度的關(guān)系

在pH值9.5，酶解時間4h，料水比1/6，加酶量1.7%下的酶解條件下，變溫度50℃、55℃、60℃、65℃、70℃下研究自由基消除率與溫度的關(guān)系。

由圖4可知，隨著溫度升高，肽得率和自由基消除率都呈上升趨勢，當溫度達到60℃時，自由基消除率和肽得率都達到最大值，接著隨著溫度的升高而降低。在溫度為60℃時，自由基消除率最高為33.43%。

圖4 自由基消除率和肽得率隨溫度變化曲線Fig4 The temperature affects on the elimination rate of free radicals and peptide yield

各種催化反應(yīng)都有最適的溫度，因為在酶的最適溫度下反應(yīng)才會進行的很快，環(huán)境的溫度對酶的作用非常顯著，酶催化反應(yīng)的溫度既影響化學反應(yīng)速度，又能影響酶蛋白的熱穩(wěn)定性。溫度對肽得率和自由基消除率的影響很明顯，從圖中可看出，在最適合的溫度范圍55℃-65℃之間，肽得率和自由基的消除率都成較大值狀態(tài)，不在這個溫度范圍內(nèi)，偏大或者偏小的溫度都很顯著的使這兩個指標降低。

2.1.5 大豆肽對二苯代苦味酰基自由基消除率與料水比的關(guān)系

在pH值9.5，酶解時間4h，溫度57℃，加酶量1.7%的酶解條件下，變料水比1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7下研究自由基消除率與料水比的關(guān)系。

圖5中顯示隨著料水比的加大，肽得率和自由基消除率均呈上升趨勢，在料水比1/6時，肽得率和自由基消除率都達到最大值。在料水比1/6時，自由基消除率達到最大為34.04%，之后呈下降趨勢。

圖5 自由基消除率和肽得率隨料水比變化曲線Fig5 Power to water affects on the elimination rate of free radicals and peptide yield

當水的比例較低時，料—底物相對較濃，空間位置較為擁擠，其底物就不足與所有的酶都結(jié)合，也存在一部分游離的酶未結(jié)合到底物，從而很多酶都沒有發(fā)揮到催化作用。因此產(chǎn)物的生成速度就比較低。但是隨水的比例增加，很多底物的空間位置越來越寬敞，而使得很多酶更充分的與底物相接觸，反應(yīng)加快，產(chǎn)物也越來越多，肽得率和自由基消除率都呈上升趨勢，生成的大豆肽也就越多，對自由基的消除率也就越大。但當所有的酶都結(jié)合了底物后，反應(yīng)速度就達到飽和狀態(tài)，這種情況下即使水的比例再增加，反應(yīng)也還是處于零級反應(yīng)狀態(tài)，肽得率不會增加，或者逐漸下降，大豆肽生成沒有很大變化，所以其抗氧化性也不會增加，自由基的消除率也變化不大。

3 結(jié)果與討論

本研究以酶解大豆肽的抗氧化性為研究對象，以二苯代苦味酰基自由基消除率為指標，固定大豆肽酶解條件中四種因素變化其中一種因素來研究其酶解條件與抗氧化性的關(guān)系。試驗結(jié)果表明大豆肽對二苯代苦味酰基自由基的清除率在水解4.5h時達到最高33.09%、在pH值為9.0左右時達到最大為33.85%、在溫度為60℃時達到最高為33.43%、在料水比1/6時，自由基消除率達到最大為34.04%。在水解的初期，大豆肽的抗氧化活性隨肽得率的增加而增加，達到一定值時，隨著肽得率的增加而減少；大豆肽的酶解條件中溫度、pH值、料水比在肽得率達到最大時，其抗氧化性也達到最大；大豆肽的酶解條件中酶解時間、加酶量在抗氧化性達到最大時，肽得率并沒有達到最大，而是之后稍有增加再減少，這說明抗氧化活力可能與肽中氨基酸排序以及肽鏈的長度有關(guān)。