酸性硫酸鈣對臨床常見致病微生物的殺滅能力

付霞麗，鄭紫方，馬志倩，徐樂樂，李志偉，李洋，肖書奇，李爽

酸性硫酸鈣對臨床常見致病微生物的殺滅能力

付霞麗，鄭紫方，馬志倩，徐樂樂，李志偉，李洋，肖書奇，李爽

西北農林科技大學動物醫學院，陜西楊凌 712100

【】研究消毒劑酸性硫酸鈣（ACS）對微生物的殺滅效果，為用消毒劑防控人畜疫病提供基礎數據和理論依據。將ACS與中和劑（3%卵磷脂、5%吐溫-80的磷酸鹽緩沖液）共孵育一段時間后，再分別加入大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）共培養一段時間，將與細菌的混合物涂布于營養瓊脂平板，置于37℃生化培養箱培養18—24 h；將與病毒的混合物接種于細胞板，在37℃細胞培養箱內培養一定時間，評價中和劑的中和效果。其對照設置和評判標準如下：消毒劑+菌懸液或病毒懸液（第1組），（消毒劑+菌懸液或病毒懸液）+中和劑（第2組），（中和劑+消毒劑）+菌懸液或病毒懸液（第3組），（無菌硬水+菌懸液或病毒懸液）+中和劑（第4組），（無菌硬水+菌懸液或病毒懸液）+PBS（第5組），無菌硬水+PBS（第6組）；細菌殺滅試驗中和劑效果評價標準：第1組有極少量細菌生長或無菌生長，第2組有菌生長且明顯少于第3、4、5組但多于第1組，第3、4、5組細菌數接近且與陽性對照組細菌數接近，第6組無菌生長，3次重復試驗均符合上述條件，結果一致，判定所選中和劑及濃度合適；病毒滅活試驗中和劑效果評價標準：第1組有極少量病毒生長或無病毒生長，第2組有病毒生長且明顯少于第3、4、5組但多于第1組，第3、4、5組病毒生長與原接種量相近，第6組細胞正常生長，3次重復試驗結果一致，判定所選中和劑及濃度合適。利用懸液定量殺菌法和測定病毒滴度的方法評價ACS對上述細菌和病毒的消滅效果，將ACS 稀釋200、300、400、500、600、700倍分別與上述細菌或病毒作用不同時間后加入中和劑進行中和，然后將細菌混合物涂布于營養瓊脂平板，通過計算菌落數評價ACS殺滅細菌的效果，測定病毒混合物中病毒滴度評價ACS對病毒的殺滅效果。所選用的中和劑能夠有效地中和ACS 200倍稀釋液對細菌和病毒的殘留作用，且該中和劑對細菌、病毒和細胞無毒性。當ACS與細菌作用0 h后立即被中和，最大稀釋300倍對大腸桿菌的滅菌率為100%，最大稀釋600倍對金黃色葡萄球菌的滅菌率為100%，最大稀釋700倍時對沙門氏菌的滅菌率為100%。當ACS 稀釋至700倍時，分別與上述細菌作用1d或6d后被中和，滅菌率均為100%；此外，ACS稀釋200倍時，與PRRSV作用60 min后被中和，未檢測出病毒滴度。ACS稀釋700倍與大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌作用1 d或1 d以上均能產生較好的殺滅效果；ACS稀釋200倍與PRRSV作用60 min能完全殺滅病毒。這可為養殖場選用消毒劑防控疫病提供參考。

酸性硫酸鈣；微生物；中和劑；殺滅效果

0 引言

【研究意義】大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）是危害人或動物健康的病原微生物，環境中若不能及時清除這些微生物，很容易造成疾病的暴發，嚴重者可導致死亡。如大腸桿菌可以導致人、畜和禽呼吸道和消化道感染，對公共衛生構成巨大威脅[1-2]。金黃色葡萄球菌可引起多種感染，造成呼吸道疾病以及其繼發的敗血癥，威脅人類健康。此外，由金黃色葡萄球菌導致的葡萄球菌乳腺炎嚴重影響牛羊等家畜的健康及乳制品品質，給養殖業帶來巨大經濟損失[3-5]。沙門氏菌是食源性致病菌，傳播力強、致病力高，每年沙門氏菌感染造成約1.15億人患病和約37萬人死亡，是公共衛生和食品安全的重要防控對象[6]。PRRSV可導致妊娠母豬繁殖障礙以及保育豬、生長豬和育肥豬的呼吸道疾病，是長期威脅養豬業健康發展的主要病原[7]。高效的消毒劑對防控病毒和細菌等致病微生物的傳播具有重要意義，如消毒劑在防控新型冠狀病毒的過程中發揮了不可替代的作用。因此，在生產實踐中應用一種安全且高效的消毒劑對人和動物的健康尤為重要。同時，消毒劑的不同作用時間和不同作用濃度對于其發揮消毒效果具有重大影響，因此，在應用高效消毒劑時，要選擇合適的濃度和作用時間。酸性硫酸鈣（ACS）是一種新型酸化劑，由氫氧化鈉、硫酸鈣、硫酸為原料混合而成，其化學本質是一種IIA族絡合物（AGIIS）的酸性溶液，但ACS中的IIA族絡合物AGIIS的元素排列與氫氧化鈣類似，這種特殊的結構使ACS在具備強酸特性的同時不具備較強的腐蝕性[8-11]，并且能與水以任意比例互溶[12]。ACS最開始是以食品添加劑的方式從美國引進[13-15]，近年來該化合物作為抑菌和殺毒劑，逐漸引起人們重視。【前人研究進展】張利平等發現ACS在700倍稀釋時殺滅金黃色葡萄球菌的效果與350 mg·L-1有效氯相當[16]。王勁等發現ACS對載體表面細菌繁殖體有較好的殺菌效果，且穩定性好[17]。談智等發現ACS對銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、脊髓灰質炎病毒具有較強的抑制作用[18]。吉鐘山等發現ACS殺滅微生物的效果與它的pH呈反比，即ACS的pH越高，其殺滅微生物的能力越弱[19]。ACS出色的抑菌和殺毒能力可能與其強酸特性有關[20]。基于ACS優良的抗微生物性能，且使用較為安全，不影響食品色澤和口感，低毒無害，被廣泛應用到食品防腐保鮮[21-22]、肉質品防腐、蔬果保鮮中，以減少蔬菜和水果中的生物毒素殘留[23-28]。2016年黃明杰等研究表明，ACS 食品保鮮機制可能是其創造較低的pH環境限制了大多數微生物的生存空間，使微生物不能生存[29]。ACS除了可以保鮮食品，還具有其他優良特點。BENLI等發現ACS添加到雞的飲用水中，可增加雞腸壁的厚度，使其不易破裂，提高飼料的轉化率[30]。且ACS作為膳食補充劑對蝦進行飼喂能提高蝦的免疫力[31]。此外，在飼料中添加ACS降低了豬的腹瀉率，且不影響豬肉品質[32]。【本研究切入點】鑒于大腸桿菌在環境中廣泛存在、金黃色葡萄球菌具有抗生素耐藥性、沙門氏菌血清型多樣化和PRRSV基因組的快速變異等問題，通過經典藥物抑制或疫苗預防這些病原微生物的傳播困難較大。利用新型藥物消滅致病微生物，可從源頭遏制疾病的傳播。ACS具有優良的殺滅病原微生物的能力，但是ACS的劑量和作用時間嚴重影響其效力，且不同微生物對藥物的反應性不盡相同。【擬解決的關鍵問題】本研究擬通過懸液定量殺菌法和病毒滴度測定法研究ACS對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的最佳抑制時間和濃度，并明確ACS在短時間內抑制PRRSV復制的效果，為拓寬ACS的應用范圍、防治人畜疾病提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗時間、地點

研究于2019年在西北農林科技大學動物醫學院完成。

1.2 試驗材料

硬水(硬度為342 mg·mL-1)由0.034 g氯化鈣、0.139 g氯化鎂加蒸餾水至1 000 mL配置而成。中和劑由含3%的卵磷脂、5%的吐溫-80的磷酸鹽緩沖液配置而成。

ACS為無色透明液體，無特殊氣味。進行殺菌試驗時，用無菌硬水配制成不同濃度的稀釋液。

試驗所用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、PRRSV均由西北農林科技大學動物醫學院動物病原微生物防控實驗室保存。

1.3 試驗方法

1.3.1 細菌懸液與病毒懸液的制備 細菌懸液的制備：取試驗菌株的斜面營養瓊脂新鮮培養物（37℃培養18—24 h），用無菌吸管吸取胰蛋白胨生理鹽水（TPS）將斜面菌苔洗下，震蕩混勻，制成細菌懸液備用（菌數范圍1×108—5×108cfu·mL-1）[33]。

病毒懸液制備：將MARC-145細胞鋪布于T75細胞瓶中，用含10% FBS 的DMEM培養基培養，置于37℃、5% CO2培養箱中培養約24 h（細胞密度為80%—90%），將病毒接種于培養有MARC-145的細胞瓶中。待有80%—90%的細胞出現細胞病變（CPE）時收獲病毒，制備病毒懸液，按Reed-Muench法計算半數組織感染量（median tissue culture infective dose，TCID50）[34]。

1.3.2 中和劑鑒定試驗 細菌殺滅試驗中和劑鑒定試驗：設計6組試驗：消毒劑+菌懸液（第1組）、（消毒劑+菌懸液）+中和劑（第2組）、（中和劑+消毒劑）+菌懸液（第3組）、（無菌硬水+菌懸液）+中和劑（第4組）、（無菌硬水+菌懸液）+PBS（第5組）、無菌硬水+PBS（第6組）。結果判定：第1組有極少量細菌生長或無菌生長；第2組有菌生長且明顯少于第3、4、5組，但多于第1組；第3、4、5組細菌數接近且與陽性對照組細菌數接近；第6組無菌生長。3次重復試驗均符合上述條件，結果一致，判定所選中和劑及濃度合適[35]。

病毒滅活試驗中和劑鑒定：試驗設計6組：消毒劑+病毒懸液（第1組）、（消毒劑+病毒懸液）+中和劑（第2組）、（中和劑+消毒劑）+病毒懸液（第3組）、（無菌硬水+病毒懸液）+中和劑（第4組）、（無菌硬水+病毒懸液）+PBS（第5組）、無菌硬水+PBS（第6組）。結果判定：第1組有極少量病毒生長或無病毒生長；第2組有病毒生長且明顯少于第3、4、5組，但多于第1組；第3、4、5組病毒生長與原接種量相近；第6組細胞正常生長。3次重復試驗結果一致，判定所選中和劑及濃度合適[18]。

1.3.3 定量殺菌試驗 試驗在室溫下進行，將ACS用無菌硬水分別稀釋200、300、400、500、600、700倍。取稀釋好的消毒液4.5 mL（陽性對照為無菌硬水）加入無菌試管中，隨后加入0.5 mL細菌懸液，充分混勻，作用不同時間后，取0.5 mL菌藥混合物（細菌懸液+消毒劑）放入含有4.5 mL中和劑試管中，充分混勻，作用10 min后稀釋接種，37℃培養18—24 h后活菌計數，計算殺菌率：殺菌率（%）=1-（殘存菌數/總菌數）×100。試驗重復3次每次2個生物學重復。

1.3.4 病毒滅活試驗 將ACS用無菌硬水分別稀釋200、300、400、500、600、700倍。取稀釋好的消毒液0.5 mL加入指形管中，室溫放置5 min后加入0.5 mL病毒懸液，混勻，作用至規定時間后，取0.1 mL加入0.9 mL的中和劑中，中和10 min，隨后取出適量中和后的混合液進行倍比稀釋，在鋪好的MARC-145的96孔板中測定病毒滴度。平均滅活對數值按下式計算：設陽性對照組（病毒）平均病毒感染滴度為N0，試驗組（消毒劑）平均病毒感染滴度為NX，平均滅活對數值=lgN0-lgNX。試驗重復3次。

2 結果

2.1 中和劑鑒定

2.1.1 定量殺菌試驗中和劑鑒定 用含3%卵磷脂，5%吐溫-80的磷酸鹽緩沖液作為中和劑，可有效中和ACS 200倍稀釋液對試驗菌的殘留作用，且中和劑溶液對試驗菌的生長和培養基狀態均無影響（表1）。

2.1.2 病毒滅活試驗的中和劑鑒定 試驗結果表明，含3%卵磷脂，5%吐溫-80的磷酸鹽緩沖液可有效中和ACS 200倍稀釋時對豬繁殖與呼吸綜合征病毒的殘留作用，且中和劑溶液和中和產物對MARC-145細胞的生長和病毒滴度均無影響（圖1）。

表1 定量殺菌試驗中和劑中和后的各試驗菌的菌落數

A：只加正常培養基的MARC-145細胞生長狀態；B：加過中和劑的MARC-145細胞生長狀態；C: 加過消毒劑的MARC-145細胞生長狀態；D: 加過中和產物的MARC-145細胞生長狀態

2.2 定量殺菌試驗

2.2.1 ACS與大腸桿菌作用 ACS與大腸桿菌懸液混勻后立即用中和劑中和，然后平板培養、計數（圖2），其在200、300倍稀釋時的滅菌率均為100%，在400倍稀釋時滅菌率為99.65%，500倍稀釋時滅菌率為99.3%，600倍稀釋時滅菌率為97.25%，700倍稀釋時滅菌率91.54%；ACS與大腸桿菌懸液混勻后室溫培養1d后再用中和劑中和，其滅菌率在200、300、400、500、600、700倍稀釋時均為100%；ACS與大腸桿菌懸液混勻后室溫培養6d后再用中和劑中和，其滅菌率在200、300、400、500、600、700倍稀釋時均為100%（表2）。

2.2.2 ACS與金黃色葡萄球菌作用 ACS與金黃色葡萄球菌懸液混勻后立即用中和劑中和，然后平板培養、計數（圖3），其在200、300、400、500、600倍稀釋時的滅菌率均為100%，在700倍稀釋時滅菌率為98.32%；ACS與金黃色葡萄球菌懸液混勻后室溫培養1d后用中和劑中和，其滅菌率在200、300、400、500、600、700倍稀釋時均為100%；ACS與金黃色葡萄球菌懸液混勻后室溫培養6d后用中和劑中和，其滅菌率在200、300、400、500、600、700倍稀釋時均為100%（表3）。

表2 不同稀釋倍數的ACS對大腸桿菌的殺滅率

表3 不同稀釋倍數的ACS對金黃色葡萄球菌的殺滅率

2.2.3 ACS與沙門氏菌作用 ACS與沙門氏菌懸液無論是混勻后立即中和，還是培養1或6d后中和，其滅菌率在200、300、400、500、600、700倍稀釋時均為100%（表4，圖4）。

2.3 病毒滅活試驗

ACS與PRRSV懸液作用60 min后，測得各個稀釋倍數的病毒滴度為：200倍稀釋時的病毒滴度的對數值為0，300倍稀釋時為2.94，400倍稀釋時為4.56，500倍稀釋時為4.63，600倍稀釋時為4.69，700倍稀釋時為4.75，陽性對照組為7.13（表5）。通過公式：平均滅活對數值=lgN0-lgNX計算ACS各稀釋濃度的平均滅活對數值。200倍稀釋時的平均滅活對數值為7.13，300倍稀釋時為4.19，400倍稀釋時為2.57，500倍稀釋時為2.50，600倍稀釋時為2.44，700倍稀釋時為2.38（表6）。

表5 與不同稀釋度的ACS作用后的病毒滴度對數值

表6 不同稀釋倍數的ACS對PRRSV的平均滅活對數值

3 討論

在2020年抗擊新冠疫情的戰役中，消毒劑發揮了不可替代的作用，它能及時殺滅環境中存在的新型冠狀病毒，有效切斷病毒的傳播途徑[36-38]。這使得人們對消毒劑在疫病防控中的作用有了更深刻的認識。在畜牧業中，每年因養殖環境消毒效果不理想所致畜禽疾病對養殖業造成巨大經濟損失。濫用抗生素導致的細菌耐藥性問題，更加重了對致病微生物防治的困難。大腸桿菌是一種常見的危害人和動物健康的致病菌，能引起人和動物腹瀉、出血性腸炎，更嚴重者可導致溶血性尿毒綜合征、終末期腎病。該菌在環境中存活率極高，普通藥物難以消滅[1-2]。金黃色葡萄球菌為呼吸道感染常見致病菌，是人和動物獲得性感染的一種主要致病菌，可引起化膿性皮膚組織感染、肺炎，重癥者可引起膿毒血癥、中毒性休克綜合征等危及生命[3-4]。沙門氏菌是一種危害較大的食源性致病菌，在我國細菌性食物中毒中，有70%—80%是由沙門氏菌引起的。PRRSV是豬場疫病防控的主要對象，因PRRSV破壞機體免疫系統，至今沒有有效的疫苗可徹底地控制該病毒的感染。因此，研究開發一種新型技術攻克致病微生物較難消滅的問題顯得尤為重要。消毒劑作為廣譜抗菌劑，因價格便宜、使用方便，在畜牧業中被廣泛使用。常見的消毒劑有乙醇、含氯消毒劑、二氧化氯、過氧乙酸、過氧化氫、季銨鹽類消毒劑。這些消毒劑雖能產生較好的消毒效果，但具有刺激氣味或腐蝕性，在日常使用時受到諸多限制。開發一種新型消毒劑迫在眉睫。

ACS作為一種酸化劑，一開始從美國引進，后來逐漸在國內推廣，常作為防腐劑廣泛應用于即食肉制品的防腐，如牛肉、火腿等，也作為殺蟲劑，替代其它有害殺蟲劑殺滅軟體昆蟲，減少樹葉和果品霉變[27,30]。ACS強酸低腐蝕的特性，使其作為消毒劑逐漸應用于畜牧業、水產養殖業等。由于我國引進ACS時間較短，其功效尚未被業界廣泛認可，因此關于其殺滅微生物的相關研究報道較少。本試驗通過研究不同濃度ACS對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的殺滅效果，發現大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌對ACS的敏感性不同。其中，沙門氏菌對ACS最為敏感，其次為金黃色葡萄球菌，最后為大腸桿菌。把不同稀釋比例的ACS分別與大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌作用不同時間，發現ACS稀釋700倍，與菌液作用1 d或1 d以上，能達到100%的滅菌效果。以上結果可為生產應用提供參考，減少ACS用量，節約成本，提高經濟效益。

除此之外，本研究還探究了ACS對PRRSV的殺滅效果。PRRSV是對豬場危害性較大的一種RNA病毒，導致豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS)，該病主要以懷孕母豬嚴重的生殖障礙以及各年齡段豬呼吸系統疾病為特征，每年給我國畜牧業造成巨大經濟損失[39-40]。該病毒可通過分泌物在群體中傳播，消滅環境中的PRRSV將有助于PRRS的防控工作。本研究結果表明，ACS稀釋200倍時與PRRSV作用60 min能完全殺滅該病毒，對PRRSV有較好的殺滅效果。ACS具有低腐蝕性，有望作為一種新興消毒劑廣泛應用于PRRSV的預防工作中。

4 結論

驗證了酸性硫酸鈣對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的殺滅效果，沙門氏菌對酸性硫酸鈣最為敏感，其次是金黃色葡萄球菌，最后是大腸桿菌。并且酸性硫酸鈣稀釋700倍時與大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌懸液作用1 d或1 d以上能達到100%的滅菌效果。200倍稀釋的酸性硫酸鈣作用60 min能完全殺滅豬繁殖與呼吸綜合征病毒。

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The Ability of Acidic Calcium Sulfate to Kill Common Clinical Pathogenic Microorganisms

FU XiaLi, ZHENG ZiFang, MA ZhiQian, XU LeLe, LI ZhiWei, LI Yang, XIAO ShuQi, LI Shuang

College of Veterinary Medicine, Northwest Agricultural and Forestry University, Yangling 712100, Shaanxi

【】The purpose was to study the effect of disinfectant acid calcium sulfate (ACS) on the killing of microorganisms, and to provide basic data and theoretical basis for disinfectant prevention and control of human and animal diseases.【】After incubating ACS with 3% lecithin and 5% Tween-80 as phosphate buffer neutralizer for a period of time,,,and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) were added respectively for a period of time, We spread the culture mixture with bacteria on nutrient agar plates and cultured at 37℃ biochemical incubator for 18-24 h, the mixture with virus was inoculated on the cell plates and incubate in 37℃ cell incubator for a certain period of time to evaluate the neutralizing effect of the neutralizer. The comparison settings and evaluation criteria were as follows: disinfectant mixed with bacterial suspension or virus suspension (group 1), the mixture of disinfectant and bacterial suspension or virus suspension was mixed with neutralizer (group 2), the mixture of neutralizer and disinfectant was mixed with bacterial suspension or virus suspension (group 3), the mixture of sterile hard water and bacterial suspension or virus suspension was mixed with neutralizer (group 4), the mixture of sterile hard water and bacterial suspension or virus suspension was mixed with PBS (group 5), sterile hard water mixed with PBS (group 6). The evaluation criteria of the neutralizer effect in the bacteria killing test were as follows: group 1 had a very small amount of bacterial growth or aseptic growth; group 2 had bacterial growth, which was significantly less than that of groups 3, 4, and 5, but more than the group 1; the number of bacteria in group 3, 4,5 was close to that of the positive control group, no bacterial growth in group 6. All three repeated tests met the above conditions, and the results were consistent, it was determined that the selected neutralizer and concentration were appropriate. The evaluation criteria of the neutralizer effect in the virus inactivation test were as follows: group 1 had very little virus growth or no virus growth; group 2 had virus growth and was significantly less than that of groups 3, 4, and 5, but more than group 1. The growth of viruses in groups 3, 4, and 5 was similar to the original inoculation; the cells in group 6 grew normally. The results of the three repeated tests were consistent, and it was determined that the selected neutralizer and concentration were appropriate. We used the suspension quantitative sterilization method and the method of determining the virus titer to evaluate the elimination effect of ACS on the above-mentioned bacteria and viruses. We diluted the ACS 200, 300, 400, 500, 600, and 700 times to interact with the above-mentioned bacteria or virus for different time and added neutralizer for neutralization, then spread the bacterial mixture on nutrient agar plates to evaluate the killing effect of ACS by calculating the number of colonies, and determined the virus titer in the virus mixture to evaluate the killing effect of ACS on the virus.【】 The selected neutralizer can effectively neutralize the residual effects of ACS 200-fold dilution on bacteria and viruses, and the neutralizer was non-toxic to bacteria, viruses and cells. When ACS interacted with the bacteria for 0 h, it was neutralized immediately. The sterilization rate ofat the maximum dilution of 300 times was 100%, the sterilization rate ofat the maximum dilution of 600 times was 100%, and when the maximum dilution was 700 times, the sterilization rate of Salmonella was 100%. When ACS was diluted to 700 times, it was neutralized one day or six days after treatment with the above bacteria, and the sterilization rate was 100%. In addition, when ACS was diluted to 200 times, it was neutralized 60 minutes after treatment with PRRSV, and no virus titer was detected.【】When ACS diluted 700 times with,andfor one day or more, it can produce better killing effect; when ACS diluted 200 times with PRRSV for 60 minutes, it can completely kill the virus, which will provide strong data support for the selection of disinfectants in the farms and provide reference for the prevention and control of epidemic diseases.

acid calcium sulfate; microbial; neutralizing agent; killing effect

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.13.018

2020-06-01；

2020-12-30

國家重點研發計劃項目（2017YFD0500605）、陜西省重點研發計劃項目（2019NY-076）、陜西高校青年創新團隊項目、西北農林科技大學試驗示范站科技創新與成果轉化項目（TGZX2020-24）

付霞麗，Tel：18702910446；E-mail:1579459296@qq.com。通信作者李爽，Tel：18700192876；E-mail：lishuang2006001@126.com

（責任編輯 林鑒非）