異硫氰酸苯酯柱前衍生高效液相色譜法測定薏苡仁中17種氨基酸的含量

伍清芳,王敏,陳鴻平,陳林,胡媛,劉友平

(成都中醫藥大學 藥學院,四川 成都,611137)

薏苡仁來源于禾本科植物薏苡(Coixlacryma-jobiL.var.ma-yuen(Roman.)Stapf)的干燥成熟種仁,屬于我國常見的傳統食品,也是衛計委公布的101種藥食同源類中藥材之一,具有利水滲濕、健脾止瀉、除痹、排膿、解毒散結的功效[1],在治療水腫、扁平疣及肝癌等疾病中均具有較好療效[2-6],具有非常高的食用及藥用價值,是各種藥品、食品、保健品開發的熱點對象之一。現代研究表明,薏苡仁除了含有脂肪酸、多糖、黃酮、三萜、生物堿等成分外[7],還含有多類氨基酸成分[8-9]。

氨基酸作為構成生命物質基礎蛋白質的基本物質和人體中不可缺少的營養成分,可用其作為衡量薏苡仁品質的指標性成分。目前,越來越多的學者采用柱前衍生化HPLC[10-19]、液相色譜-質譜聯用儀(liquid chromatograph mass spectrometer,LC-MS)[20-24]、高效液相色譜-熒光檢測法(liquid chromatograph fluorescent detection,LC-FLD)[25]等方法分析鹿茸片、玉米等多種物質中的氨基酸成分,檢測方法更加簡便、準確和高效。本研究采用異硫氰酸苯酯(phenyl isothiocyanate,PITC)對薏苡仁氨基酸進行柱前衍生化,即在堿性條件下,氨基酸成分與PITC相結合生成具有紫外吸收的化合物,利用HPLC對其進行氨基酸組成分析和含量測定,以期為薏苡仁在食品、藥品及保健品方面的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

天冬氨酸(Asp,批號CHB170224)、L-谷氨酸(Glu,批號CHB180617)、L-天冬酰胺(Asn,批號CHB190213)、L-絲氨酸(Ser,批號CHB170221)、L-組氨酸(His,批號CHB181129)、L-精氨酸(Arg,批號CHB190120)、L-蘇氨酸(Thr,批號CHB190215)、L-α-丙氨酸(Ala,批號CHB180307)、L-脯氨酸(Pro,批號CHB180904)、L-酪氨酸(Tyr,批號CHB190110)、L-纈氨酸(Val,批號CHB180313)、L-甲硫氨酸(Met,批號CHB180227)、L-胱氨酸(Cys,批號CHB180410)、L-異亮氨酸(Ile,批號CHB170921)、L-亮氨酸(Leu,批號CHB170712)、L-苯丙氨酸(Phe,批號CHB170414)、L-賴氨酸(Lys,批號CHB180111),對照品純度均大于98%,成都克洛瑪生物科技有限公司；三乙胺溶液、PITC試劑、正己烷溶液皆為實驗用分析純,乙腈為色譜純。16批薏苡仁樣品經成都中醫藥大學藥學院嚴鑄云教授鑒定均為禾本科植物薏苡Coixlacryma-jobiL.var.ma-yuen(Roman.)Stapf的干燥成熟種仁,見表1。

表1 薏苡仁樣品信息

1.2 實驗儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀,安捷倫科技(中國)有限公司；SQP萬分之一天平,賽多利斯儀器(北京)有限公司；B25-12D超聲波清洗儀,寧波新藝超聲設備有限公司；DHS16-A多功能紅外水份儀,上海精密科學儀器有限公司；TGL-16臺式高速冷凍離心機、TDZ5-WS多管架自動平衡離心機,湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；DHG—9245電熱鼓風干燥箱,上海一恒科學儀器有限公司；HH-1恒溫水浴鍋,國華電器有限公司；DY-3型電動熔封機,長沙市岳麓區中南制藥機械廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 對照品溶液的制備

分別稱取適量氨基酸對照品,加入10 mL容量瓶內,精密稱定,加入0.1 mol/L HCl溶液,溶解定容,制備成各氨基酸濃度范圍為58.0～399 μg/mL的混合氨基酸對照品儲備液。

1.3.2 供試品溶液的制備

精密稱定薏苡仁樣品粉末0.2 g,置于可熔封安瓿瓶中,精密加入6 mol/L HCl溶液5 mL,然后熔封,150 ℃烘箱中加熱反應1 h,取出置冷卻,轉移至5 mL EP管,以轉速10 000 r/min離心10 min,取1 mL上清液至安瓿瓶,水浴蒸干,待冷卻至常溫,加入0.1 mol/L HCl溶液,使其充分溶解后,將溶液轉移至5 mL容量瓶中定容,即得薏苡仁供試品溶液。

1.3.3 衍生化

精密移取混合氨基酸對照品稀釋溶液、薏苡仁供試品溶液和400 μL 0.1 mol/L HCl溶液至EP管,依次加入200 μL新鮮配制的1 mol/L三乙胺-乙腈溶液和200 μL新鮮配制的0.1 mol/L PITC-乙腈溶液,振蕩混勻,避光1 h,再加入600 μL正己烷溶液,振蕩混勻,靜置10 min,取200 μL下層清液,加入800 μL超純水進行稀釋,渦旋混勻,用0.22 μm 微孔濾膜過濾,置于進樣瓶中,得到空白、對照品、薏苡仁供試品溶液。

1.3.4 色譜條件

色譜柱采用SVEA C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相A：體積分數80%乙腈水溶液,流動相B：0.1 mol/L醋酸鈉-乙腈(6∶94體積比),梯度洗脫：0～4 min,0%A；4～6 min,0%～6%A；6～16 min,7%A；16～20 min,7%～12%A；20～40 min,12%～25%A；40～49 min,25%～35%A；49～55 min,35%～100%A；55～60 min,100%A；60～65 min,100%～0%A。流速0.8 mL/min,進樣量5 μL,柱溫38 ℃,檢測波長254 nm。按上述條件操作,對照品及供試品中17種氨基酸的色譜峰分離效果良好,見圖1。

1-Asp；2-Glu；3-Asn；4-Ser；5-His；6-Arg；7-Thr；8-Ala；9-Pro；10-Tyr；11-Val；12-Met；13-Cys；14-Ile；15-Leu；16-Phe；17-Lys

2 結果與分析

2.1 主成分分析及聚類分析

根據表5的回歸方程可計算得到薏苡仁樣品17種氨基酸含量,見表2。可得各產地薏苡仁總氨基酸含量為122.6～274.0 μg/g,共檢測到17種氨基酸,含7種人體必需氨基酸,以異亮氨酸、酪氨酸含量較高,以貴州省興仁縣產的薏苡仁總氨基酸含量最高。

為了進一步分析不同產地薏苡仁中的17種氨基酸成分差異,評價其質量,采用軟件SPSS 26.0對薏苡仁氨基酸含量進行了主成分分析和系統聚類分析。由相關矩陣特征值的計算結果可知,前3個主成分(天冬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸)累計方差貢獻率高達85.06%(表3),鑒于此結果選取了前3個主成分對薏苡仁品質進行評價,見表4。

表4 因子載荷矩陣

用特征值和各因子載荷矩陣對各氨基酸得分系數進行計算,可以進一步得到PC1、PC2、PC3和綜合得分Y方程式如下:

PC1=0.058X1+0.071X2+0.083X3+0.065X4+0.051X5+0.054X6+0.093X7+0.07X8+0.078X9+0.084X10+0.094X11+0.09X12+0.078X13+0.073X14+0.089X15+0.096X16+0.038X17

PC2=-0.077X1-0.171X2-0.134X3+0.027X4-0.02X5-0.202X6+0.07X7+0.211X8+0.175X9-0.122X10-0.015X11-0.096X12+0.175X13-0.161X14+0.1X15+0.053X16+0.191X17

PC3=0.22X1+0.101X2+0.045X3+0.398X4-0.325X5+0.146X6+0.097X7+0.001X8-0.099X9-0.04X10-0.131X11+0.036X12-0.099X13-0.2X14-0.141X15-0.074X16+0.327X17

Y=0.594 8PC1+0.192 8PC2+0.060 1PC3

X1～X17分別為各氨基酸的標準化值。利用上述公式計算各產地薏苡仁氨基酸主成分綜合得分,值越高,表明薏苡仁氨基酸質量越佳,按照結果進行排序,可得到貴州興仁縣產的薏苡仁氨基酸質量最佳,見表2,根據主成分得分繪制的三維圖見圖2。

圖2 主成分得分三維圖

由系統聚類結果得到16個產地薏苡仁樣品被聚為5類,黑龍江綏化市、吉林省吉林市、廣東省東莞市、廣東省蒲城市、云南省鹽津縣、湖北省湘潭市、湖北省黃岡市、河北省滄州市、內蒙古通遼市、貴州省青山市產薏苡仁為第1類,緬甸產薏苡仁為第2類,福建省龍巖市、江西省樟樹市、云南省勐臘縣產薏苡仁為第3類,海南省海口市產薏苡仁和貴州省興仁縣產薏苡仁分別為第4類和第5類,見圖3。

圖3 系統聚類分析圖

2.2 方法學考察

2.2.1 線性關系考察

精密量取氨基酸混合對照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL,分別置于10 mL容量瓶中,用0.1 mol/L HCl溶液稀釋定容,即得不同梯度濃度的氨基酸混合對照品溶液,按1.3.3的方法進行衍生并測定,以濃度(x,mg/mL)為橫坐標,峰面積(y,mAU)為縱坐標,進行線性回歸,結果表明實驗所用的17種氨基酸在限定濃度范圍內均有良好線性關系,見表5。

表5 十七種氨基酸的回歸方程及相關系數

2.2.2 精密度試驗

將混合對照品儲備液按一定比例稀釋,取稀釋液適量,遵循1.3.2的方法制備供試品溶液,計算可得17種氨基酸峰面積的相對標準偏差(n=6)為0.26%～3.42%,本實驗所用儀器精密度良好。

2.2.3 穩定性試驗

取樣品S1制備供試品溶液,分別于0、4、8、12、16、24 h進樣檢測,計算得到不同時間點17種氨基酸對應峰面積相對標準偏差(n=6)為0.72%～3.36%,樣品穩定性良好。

2.2.4 重復性試驗

精密稱定6份質量相等的樣品S1,制備供試品溶液,由計算結果可得各氨基酸含量相對標準偏差(n=6)為0.63%～3.81%,可知該方法重復性良好。

2.2.5 加樣回收率試驗

精密量取6份濃度確定的S1水解液樣品各200 μL,分別加入稀釋后的混合對照品溶液,并制備供試品溶液,得到氨基酸含量、計算回收率以及相對標準偏差,計算可得17種氨基酸的平均加樣回收率為97%～101%,相對標準偏差為0.89%～4.86%。

3 結論與討論

本研究表明藥食兩用薏苡仁中含有豐富的氨基酸成分,共檢測得到17種氨基酸,包括7種人體必需氨基酸，為賴氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸以及蘇氨酸,其中以異亮氨酸含量為最高。其余10種人體非必需氨基酸中,酪氨酸含量最高。李恃圻等[8]、樂巍等[9]采用氨基酸自動分析儀檢測薏苡仁氨基酸得到的氨基酸種類與本研究結果大致相似,部分氨基酸含量略有差異,推測可能是薏苡仁的品種、采收期、貯藏條件等因素差異導致。

本研究建立了PITC柱前衍生化HPLC檢測薏苡仁中氨基酸含量的方法,方法簡單實用,能準確檢測薏苡仁中17種氨基酸的含量,為薏苡仁中氨基酸含量測定及薏苡仁質量評價提供了新方法。同時,對貴州、云南和福建等16個產地的薏苡仁中氨基酸含量進行了主成分分析,得到不同產地薏苡仁氨基酸含量有一定差異,以貴州省興仁縣產薏苡仁中總氨基酸含量最高,表明薏苡仁質量與產地存在一定相關性。可針對產地對薏苡仁綜合質量評價進行研究,為薏苡仁種植基地的選擇和發展提供新的思路。