高效液相色譜-串聯質譜法測定動物源性食品中噻節因殘留

肖泳,周叢,鄧航,馮燕英,潘照,唐吉旺,袁列江

(湖南省產商品質量監督檢驗研究院,湖南 長沙,410007)

噻節因(dimethipin)是一種植物生長調節劑,可促進植物成熟,使玉米、苗木、橡膠樹和葡萄落葉,并能降低收獲后水稻和向日葵種子的含水量。噻節因具有中等毒性,長期使用可能對生態和食品安全產生較大風險。美國環保局將噻節因列為可能的人類致癌物,目前歐盟禁止噻節因在農作物上使用,國際食品法典委員會、美國、日本等國家或組織制定了食品中噻節因的最大殘留限量。我國食品安全國家標準(GB 2763—2019)中也制定了油料和油脂、馬鈴薯、哺乳動物肉類及內臟(海洋哺乳動物除外)、禽肉類、禽類內臟、蛋類、生乳中噻節因的最大殘留限量值,但該標準中哺乳動物肉類及內臟(海洋哺乳動物除外)、禽肉類、禽類內臟、蛋類、生乳中噻節因的測定是參照蜂蜜(GB/T 20771—2008)的方法。

目前,國內外關于食品中噻節因的檢測方法主要有氣相色譜法[1]、液相色譜法[1-2]、氣質聯用法[1,3-11]、液質聯用法[12-14]。氣相色譜法和氣質聯用法前處理較繁瑣、耗時較長;液相色譜法靈敏度低;液質聯用法前處理相對簡便且具有高特異性和高靈敏度,但現有文獻方法大多針對果蔬類樣品,對動物源性食品中噻節因檢測的研究較少。本文以動物源性食品為研究對象,采用內標法定量,建立了高效液相色譜-串聯質譜法測定動物源性食品中噻節因殘留的分析方法,并研究了離子源、色譜柱、流動相、提取溶劑、凈化方式、固相萃取柱等因素對噻節因的離子化程度、提取效率及凈化效果的影響。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Vanquish-TSQ Quantis高效液相色譜-串聯質譜儀,美國Thermo公司；MV5多通道氮吹濃縮儀、DHS-220雙模式自動均質儀,北京萊伯泰科有限公司；Allegra 64R高速冷凍離心機,美國Beckman Coulter公司；GM200刀式研磨儀,德國Retsch公司；Venusil MP C18(2)色譜柱(150 mm×2.1 mm,3 μm),天津博納艾杰爾科技有限公司；C18固相萃取柱(2 g,12 mL),北京中檢維康技術有限公司。

噻節因(純度99.0%)、4-羥基苯甲酸異丁酯(純度99.0%),德國Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈、正己烷、甲酸、乙酸,均為HPLC級,上海安譜公司；MgSO4、NaCl,均為分析純,國藥集團有限公司。

稱取適量噻節因和4-羥基苯甲酸異丁酯標準品,分別用乙腈配制成1.0 mg/mL的標準儲備液(噻節因可加少量丙酮溶解再用乙腈定容),于0～4 ℃冰箱中儲存。根據需要將噻節因標準儲備液用乙腈稀釋成適當濃度的標準工作液,將4-羥基苯甲酸異丁酯內標儲備液用乙腈稀釋成100 ng/mL的內標工作液,于0～4 ℃冷藏儲存,備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備

豬、牛、羊、雞等畜禽類樣品取可食肌肉組織、內臟約200 g,切碎后經組織搗碎機搗碎均勻,裝入潔凈容器內,密封,于-20 ℃以下冷凍保存；蛋類取10枚,去殼后經組織搗碎機充分混勻,裝入潔凈容器內,密封,于-20 ℃以下冷凍保存；生乳樣品取約200 g充分混勻,裝入潔凈容器內,密封,于-20 ℃以下冷凍保存。

1.2.2 樣品前處理

稱取5 g(精確至0.01 g)制備均勻的樣品,置于50 mL具塞離心管中,加入5 mL水(生乳不用加水),準確加入50 μL內標工作溶液(100 ng/mL),混勻靜置20 min；加入25 mL體積分數1%的乙酸乙腈溶液,15 000 r/min均質2 min,加入1～2 g NaCl、2～3 g MgSO4,快速混勻2 min,7 000 r/min離心5 min,取15 mL提取液,用2×10 mL乙腈飽和的正己烷脫脂2次,準確移取其中10 mL提取液于40 ℃氮吹濃縮至約1 mL,待進一步凈化。

用10 mL乙腈活化C18固相萃取柱,上樣,用10 mL乙腈洗脫,接收提取液和洗脫液,于40 ℃氮吹濃縮至近干,用1.0 mL乙腈-水溶液[V(乙腈)∶V(水)=3∶2]溶解殘渣,過0.22 μm有機濾膜后供高效液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.2.3 色譜和質譜條件

色譜柱Venusil MP C18(2)柱(150 mm×2.1 mm,3 μm)；柱溫40 ℃；流速0.4 mL/min；流動相A為水,流動相B為乙腈。梯度洗脫程序：0～1.00 min,10%B～60%B；1.00～3.50 min,60%B～95%B；3.50～4.00 min,95%B；4.00～4.01 min,95%B～10%B；4.01～5.00 min,10%B。進樣體積10 μL。

離子源：大氣壓化學電離源(atmospheric pressure chemical ionization source，APCI)；掃描模式：負離子掃描；掃描方式：多反應監測；離子傳輸管溫度310 ℃；蒸發溫度325 ℃；鞘氣流量8.4 L/min；輔助氣流量2.42 L/min；放電電流：5 μA；其他質譜條件見表1。

表1 噻節因和4-羥基苯甲酸異丁酯的質譜參數

2 結果與討論

2.1 質譜條件的選擇

液質聯用法檢測噻節因常用的離子源有電噴霧離子源(electron spray ionization, ESI)[13-14]和APCI源[12]。本方法配制10 mg/L的噻節因標準溶液和1 mg/L的4-羥基苯甲酸異丁酯內標溶液,注入ESI源和APCI源,并分別在正離子和負離子模式下進行一級質譜圖全掃描,確定母離子,然后對準母離子進行子離子掃描,不同模式下二級離子碎片質譜圖見圖1。結果表明,噻節因在APCI源中的離子化效果要優于ESI源,且負離子模式下的響應明顯高于正離子模式,與楊濤等[12]的研究結果一致。因此,選擇APCI源負離子模式對噻節因和4-羥基苯甲酸異丁酯進行離子化,并在多反應監測模式下優化各種質譜參數,得到最佳質譜條件,噻節因和4-羥基苯甲酸異丁酯的質譜參數見表1。

a-噻節因：APCI-；b-噻節因：APCI+；c-噻節因：ESI-；d-4-羥基苯甲酸異丁酯：APCI-

2.2 色譜條件的選擇

色譜柱的選擇對樣品的分離十分重要,通常不同類型的填料對同一樣品有不同的保留效果。本文重點比較了Venusil MP C18(2)柱(150 mm×2.1 mm,3 μm)和Venusil HILIC柱(150 mm×2.1 mm,3 μm)對目標化合物的保留情況,并采用同濃度的標準溶液考察了分別以乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液和乙腈-10 mmol/L乙酸銨水溶液作流動相時,對目標化合物離子化程度的影響(圖2)。結果表明,采用MP C18(2)柱,以乙腈-水作為流動相時,噻節因的響應明顯高于其他2種流動相；采用HILIC柱,以乙腈-10 mmol/L乙酸銨水溶液作為流動相時,噻節因的響應明顯高于其他2種流動相。這2種色譜柱最佳流動相條件下噻節因的響應相差不大,但是MP C18(2)柱對噻節因的保留效果要優于HILIC柱,且流動相中不需要添加銨鹽。因此,選擇Venusil MP C18(2)柱作為噻節因的分離色譜柱,并以乙腈-水作為流動相進行梯度洗脫。

a-色譜柱：MP C18(2),流動相：乙腈-水；b-色譜柱：MP C18(2),流動相：乙腈-0.1%甲酸水溶液；c-色譜柱：MP C18(2),流動相：乙腈-10 mmol乙酸銨水溶液；d-色譜柱：HILIC,流動相：乙腈-水；e-色譜柱：HILIC,流動相：乙腈-0.1%甲酸水溶液；f-色譜柱：HILIC,流動相：乙腈-10 mmol乙酸銨水溶液

2.3 提取和凈化條件的優化

噻節因常用的提取溶劑有乙腈[13-14]、體積分數1%的乙酸乙腈溶液[3-4,7]、丙酮[12]等。李南等[7]比較了正己烷、丙酮、純乙腈和1%的乙酸乙腈溶液對堅果中農藥的提取效果,最終得出1%的乙酸乙腈溶液效果最佳；張煜卓等[10]比較了乙腈、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷對南果梨中農藥的提取效果,最終得出乙腈效果最佳；楊濤等[12]比較了乙腈、甲醇、丙酮、水和丙酮-水等體積混合對果蔬中噻節因的提取效果,最終得出丙酮效果最佳。對于動物源性食品,由于脂肪含量高,丙酮提取液濃縮后呈黏稠狀液體,不利于后期凈化；乙腈和1%的乙酸乙腈溶液作為提取溶劑,方法回收率均可達80%以上,當用正己烷對提取液進行脫脂處理后,發現提取液明顯變得澄清,且不會影響噻節因的回收率；采用含1%的乙酸乙腈溶液作為提取溶劑,可以進一步沉淀動物源性樣品中的蛋白質,使上機待測液較純乙腈作為提取溶劑時更澄清。因此,實驗選擇體積分數1%的乙酸乙腈溶液作為提取溶劑,并用正己烷對提取液進行脫脂處理。

噻節因凈化常用的固相萃取柱有NH2柱、GCB+NH2柱、C18柱、PSA柱、弗羅里硅土柱、中性氧化鋁柱等,研究發現,NH2柱(500 mg/3 mL)、GCB+NH2柱(500 mg/500 mg/6 mL)、中性氧化鋁柱(500 mg/3 mL)均會吸附內標4-羥基苯甲酸異丁酯。進一步比較了C18柱(500 mg/3 mL)、PSA柱(500 mg/3 mL)、弗羅里硅土柱(500 mg/3 mL)對提取液的凈化效果,結果顯示,對于肝臟類樣品,PSA柱、弗羅里硅土柱可以吸附提取液中大部分極性色素,但是洗脫液濃縮復溶過膜后呈黃色渾濁狀,表明這2種固相萃取柱對其他雜質的凈化效果不明顯,與李南等[7]的研究結果相近。而提取液經C18柱凈化、濃縮、復溶過膜后溶液較為澄清透明,當C18固相萃取柱規格提高至2 g/12 mL時,復溶液過膜后明顯變得澄清透明。因此,實驗最終選擇C18固相萃取柱(2 g/12 mL)進行凈化。

2.4 方法學評價

2.4.1 基質效應

基質效應是影響結果準確性的一個重要因素,在質譜方法開發和確證過程中需要對基質效應做出評價。為了考察本方法在去除基質效應方面的效果,按照MATUSZEWSKI等[15]的方法對其進行基質效應評估。實驗選擇豬肉、牛肝、雞蛋、牛奶4種陰性樣品,按照1.2節進行前處理,獲得的基質提取液分別配制質量濃度為100 μg/L基質標準溶液(含內標2 μg/L)。此外,用乙腈-水溶液[V(乙腈)∶V(水)=3∶2]配制同樣質量濃度的標準溶液,按照公式(1)計算方法的基質效應。

(1)

研究表明,當用外標法計算時,這4種基質的基質效應值為92.5%～97.1%；當用內標法計算時,這4種基質的基質效應值為94.3%～98.7%,說明采用該方法測定動物源性食品中噻節因殘留量時無需配制基質標準曲線,主要是APCI對基質效應的敏感程度要低于ESI,與文獻[13-14]中方法相比,對雞肉、雞蛋中噻節因殘留的研究基質干擾更小。

2.4.2 線性范圍和定量限

配制質量濃度為1、2、5、10、50、100、200、500 μg/L的系列標準溶液(含內標2 μg/L),對噻節因和內標4-羥基苯甲酸異丁酯定量離子的峰面積之比(y)與噻節因的質量濃度(x,μg/L)進行線性回歸,繪制標準曲線,其線性方程為y=0.077 87x-0.024 62,相關系數(R2)為0.999 3。研究表明,噻節因在1～500 μg/L范圍內線性關系良好,且滿足GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》附錄F中對于確證方法相關系數≥0.99的要求。

在陰性樣品中添加噻節因,按照1.2節進行前處理上機測定,以10倍信噪比(S/N)為定量限,得到噻節因的方法定量限為1.0 μg/kg,完全滿足各國限量標準要求,且同現有方法相比具有更高的靈敏度[3,12-14]。

2.4.3 準確度和精密度

通過對陰性樣品進行加標回收,考察方法的準確度和精密度。按照1.2節提取和凈化步驟,在豬肉、豬肝、牛肉、牛肝、羊肉、羊肝、雞肉、雞胗、雞蛋和牛奶10種基質樣品中添加定量的噻節因標準溶液進行加標回收試驗,加標量分別為1.0、10.0和100.0 μg/kg,每個加標水平做6個平行,試驗結果見表2。

表2 不同基質中噻節因的加標回收率和精密度(n=6)

結果顯示,在3個加標水平下,豬肉、豬肝、牛肉、牛肝、羊肉、羊肝、雞肉、雞胗、雞蛋和牛奶中噻節因的平均回收率為89.0%～105.0%,相對標準偏差為2.20%～7.64%。說明方法的準確度高,通用性好,且方法的回收率優于現有研究[3,12-14],完全滿足GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》附錄F中檢測方法確認回收率和精密度要求。

2.5 實際樣品的測定

運用本文建立的方法,對市售的畜禽肉及肝臟類、蛋類、牛奶共40份樣品進行噻節因的殘留檢測,所有樣品均為陰性。

3 結論

本文建立了高效液相色譜-串聯質譜測定動物源性食品中噻節因殘留的分析方法,方法操作簡單,基質干擾小,定性準確,靈敏度高,線性關系、準確度和精密度均滿足方法學指標,方法定量限完全滿足各國限量標準要求,可為動物源性食品中噻節因的殘留檢測提供技術手段。