低劑量右美托咪定可減輕早期膿毒癥大鼠胃體細胞凋亡

林雅萍，朱丹丹，林 艷

(福建中醫藥大學附屬福州市中醫院麻醉科，福建 福州 350001)

膿毒癥是最為常見的臨床急危重癥之一，其發病率及病死率高居不下[1-2]。正常的胃腸功能有助于防止腸道菌群易位，避免發生及加重膿毒癥。然而，膿毒癥后常常因為劇烈的全身炎性反應及血容量再分布而產生胃腸功能紊亂，甚至誘發應激性潰瘍，且以胃底、胃體最為多見[3]。所以膿毒癥胃黏膜保護顯得尤為重要，包括制酸劑、胃黏膜保護劑的使用。近年有研究發現，右美托咪定具有免疫調節作用，可抑制細胞凋亡而減輕腸缺血再灌注損傷[4-5]。右美托咪定是新型α2腎上腺素受體激動劑，因其可靠的鎮靜作用，廣泛應用于臨床[6]。本研究旨在通過動物試驗，探討右美托咪定對膿毒癥早期大鼠胃體黏膜損傷抗凋亡保護作用?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1動物模型及標本制備：清潔級SD健康雄性大鼠32只(購自福建吳氏實驗動物公司)，體重180～220 g，隨機數字法隨機分為正常組(C組)，膿毒癥組(S組)、膿毒癥+右美托咪定高劑量組(H組)及膿毒癥+右美托咪定低劑量組(L組)，每組大鼠8只(詳見圖1)。S組、H組及L組大鼠予腹腔注射脂多糖(1 mg/100 g)腹腔注射誘導模型[7]，并記時間軸為0時，C組大鼠腹腔注射同等劑量生理鹽水。H組大鼠4 h后沿尾靜脈以5 μg/(kg·h)泵注右美托咪定(Dexmedetomidine,DEX)持續2 h，L組大鼠4 h后以10 μg/(kg·h)泵注DEX持續2 h[8]，C組及S組泵注生理鹽水。大鼠以固定器妥善固定后，將鼠尾浸泡在46～50℃的溫水中2 min后取出，尾靜脈穿刺留置針置管(26G)，固定鼠尾進行藥物微注泵入。泵注結束后采用大鼠無創血壓測量儀(北京軟隆 BP-2010A)測量尾動脈平均動脈壓、脈率。24 h后心臟穿刺采血1 ml用于白介素-6(Interleukin-6,IL-6)及腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)的檢測，隨后采用頸椎脫臼法處死大鼠后迅速開腹取1.0 cm×1.0 cm大小胃底組織共2份，冰鹽水洗凈后一份凍存于-20℃，用于Western blot檢測凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9的表達；另一份于4%多聚甲醛固定用于TUNEL法檢測凋亡系數。采血處死后10 min內完成標本。見圖1。實驗過程中動物處置方法均符合動物倫理學標準且本次研究經過本院醫學倫理委員會同意。

圖1 大鼠試驗流程圖

1.2試驗材料：脂多糖(Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4)購自美國SIGMA公司(批號L2630)；右美托咪定購自四川國瑞藥業有限責任公司(批號1910201)； IL-6及TNF-α采用ELISA法檢測，試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司(批號SEKR-0005及SEKR-0009)；Caspase-3、Caspase-9蛋白WB檢測一抗均購自Thermo Fisher公司(批號43-7800及PA5-22252)；TUNEL試劑盒購自Roche公司(批號19684817510)，組織石蠟切片經TUNEL染色后凋亡細胞被染色成深褐色，由專業人員進行閱片計數，每張片分別3次各計數100個細胞，凋亡系數=凋亡細胞/100，三次取均值為該標本凋亡系數。操作嚴格按照各指標說明書進行。

2 結果

2.1不同組大鼠腹腔注射脂多糖后一般情況：C組大鼠精神狀態好，活動自如，毛色有光澤；S組、H組及L組大鼠腹腔注射脂多糖后1 h均有不同程度無精打采、立毛、震顫、呼吸急促。24 h后觀察大鼠，S組及H組各有2只出現腹瀉，所有動物均未觀察到眼眶后滲出改變，各組大鼠死亡例數均為0。24 h處死大鼠剖腹可見明顯渾濁腹水，腸管不同程度充血腫脹。以上癥狀及腹部情況表明，與C組對比，S組、H組及L組大鼠予LPS腹腔注射后均能均一化地誘導為膿毒癥模型。

2.2不同組大鼠平均動脈壓、脈率的比較：單因素方差分析提示三組大鼠尾動脈平均動脈壓存在統計學差異，S組[(112.500±16.844)mm Hg(1 mm Hg=0.133 3 kPa)]與C組[(138.875±14.545)mm Hg]對比存在統計學差異；與S組對比，H組[(83.875±8.408)mm Hg]顯著性低下，但L組[(108.25±10.389)mm Hg]與S組無差異；L組大鼠平均動脈壓顯著性高于H組。對比三組大鼠尾動脈脈率(次/min)提示統計學差異，腹腔注射LPS后，S組[(335.125±10.696)次/min]明顯高于C組[(280.625±10.295)次/min]，同時高于藥物干預的H組[(208.875±14.662)次/min]及L組[(259.500±19.741)次/min]，高劑量的H組顯著性低于低劑量L組。見圖2。

注：不同組大鼠尾靜脈平均動脈壓及脈率均采用方差分析(平均動脈壓對比F值=24.099，P<0.001；脈率對比F值=105.962，P<0.001)。兩兩對比均采用LSD-t檢驗，平均動脈壓對比，t(C組、S組)=26.375，P<0.005，t(S組、H組)=28.625，P<0.001,t(S組、L組)=4.25，P=0.518,t(H組、L組)=24.375，P=0.001;脈率對比，t(C組、S組)=-54.5，P<0.001，t(S組、H組)=126.25，P<0.001,t(S組、L組)=75.625，P<0.001,t(H組、L組)=-50.625，P<0.001。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，NS代表P>0.05圖2 不同組大鼠尾動脈平均動脈壓及脈率的比較(n=8)

2.3不同組大鼠IL-6、TNF-α的比較：對比分析三組大鼠血IL-6及TNF-α呈現相同的差異趨勢，造模后S組IL-6[(94.818±9.163)pg/ml]明顯高于C組[(1.240±1.023)pg/ml]，高劑量使用DEX后，H組IL-6[(76.020±11.825)pg/ml]低于S組，但與L組[(84.653±15.379)pg/ml]比較，差異無統計學意義(P>0.05)，L組與S組之間無差異。各組大鼠進行TNF-α對比，S組TNF-α[(115.281±18.962)pg/ml]高于C組[(11.848±4.539)pg/ml]，H組TNF-α[(87.774±14.007)pg/ml]低于S組，但與L組[(101.416±15.140)pg/ml]比較，差異無統計學意義(P>0.05)，L組與S組對比同樣無差異。見圖3。

注：不同組大鼠IL-6、TNF-α均采用方差分析(IL-6對比F值=126.225，P<0.001；TNF-α對比F值=84.808，P<0.001)。兩兩對比均采用LSD-t檢驗，IL-6對比，t(C組、S組)=-93.577，P<0.005，t(S組、H組)=18.797，P=0.002,t(S組、L組)=10.164，P=0.069,t(H組、L組)=-8.632，P=0.119;TNF-α對比，t(C組、S組)=-103.433，P<0.001，t(S組、H組)=27.507，P=0.001,t(S組、L組)=13.865，P=0.061,t(H組、L組)=-13.642，P<0.065。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，NS代表P>0.05圖3 不同組大鼠血白介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)的比較(n=8)

2.4不同組大鼠胃底組織TUNEL染色及Caspase-9、Caspase-3蛋白表達的比較：四組大鼠進行TUNEL染色。對比C組，LPS造模后的S組大鼠胃底細胞凋亡指數顯著性升高；進行DEX干預后,與S組對比，L組大鼠凋亡細胞顯著性減輕，但加大DEX用量的H組并未表現出細胞凋亡減少。在Caspase-3蛋白表達量上觀察到同樣的差異，S組 Caspase-3蛋白表達量最高，H組及L組均低于S組，但只有L組有統計學差異。Caspase-9蛋白的表達中，H組及L組與S組對比均無顯著性差異。見圖4～6。

注：不同組大鼠胃體組織切片，TUNEL法染色后凋亡細胞被染成深褐色(箭頭所示),400倍光學顯微鏡下進行凋亡細胞計數。A為C組見多數胃底細胞核淡紫色，未見明顯深褐色染色細胞；B為S組，深褐色染色細胞較多，且細胞排列紊亂；C為H組大鼠胃底組織，深褐色著色細胞亦較多；D為L組大鼠，凋亡細胞較S組及H組減少圖4 不同組大鼠胃體組織TUNEL染色切片(×400)

圖5 不同組大鼠胃底組織Caspase-9及Caspase-3進行Western blot條帶圖

注：H值為各組參數進行Kruskal-Wallis H檢驗所得統計量，凋亡系數對比H值=24.905，P<0.001；Caspase-9相對灰度值對比H值=22.534，P<0.001；Caspase-3相對灰度值對比H值=23.673，P<0.001。兩兩對比采取Nemenyi法，凋亡系數對比，χ2(C組、S組)=-22.688，P<0.001，χ2(S組、H組)=-8.0，P=0.526,χ2(S組、L組)=-13.562，P=0.023,χ2(H組、L組)=-5.562，P=0.235;Caspase-9相對灰度值對比，χ2(C組、S組)=-21.0，P<0.001，χ2(S組、H組)=-4.750，P=0.311,χ2(S組、L組)=-11.250，P=0.099,χ2(H組、L組)=-6.50，P=0.166;Caspase-3相對灰度值對比，χ2(C組、S組)=-22.50，P<0.001，χ2(S組、H組)=-8.875，P=0.351,χ2(S組、L組)=-12.625，P=0.043,χ2(H組、L組)=-3.75，P=0.424。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，NS代表P>0.05圖6 不同組大鼠胃底組織凋亡系數、Caspase-9及Caspase-3相對灰度值比較(n=8)

3 討論

膿毒癥后大量炎性介質進入血液循環，劇烈的炎性反應有誘導靶器官細胞凋亡，引起臟器功能損害[9]，其中急性胃黏膜病變，如應激性潰瘍伴出血的發生將嚴重威脅患者預后[3]。本研究旨在針對膿毒癥早期強烈的炎性反應風暴階段，探討右美托咪定對胃體黏膜的影響，本研究發現右美托咪定可降低LPS誘導的膿毒癥早期大鼠的脈率，而高劑量使用DEX會使原本不高的血壓進一步降低，而低劑量則對血壓影響不大；監測炎性反應指標，高劑量表現出更加明顯的IL-6、TNF-α下降，在低劑量大鼠中同樣有下降趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)；同時低劑量DEX干預后可減少膿毒癥大鼠胃體細胞凋亡，加大劑量干預則并無統計學差異(P>0.05)。

膿毒癥大鼠模型技術成熟穩定，主要有三種方式：腹腔注射脂多糖、細菌接種及盲腸結扎穿孔術造模[10]。為避免腹部手術對大鼠胃體不必要的創傷性影響，本研究采用腹腔注射脂多糖制作膿毒癥模型，造模后大鼠有豎毛、寒戰、呼吸急促，精神萎靡，毛松，剖腹可見渾濁腹水，惡臭，腸管充血腫脹，與李佳紅等研究結果[7]相符，同時監測IL-6、TNF-α明顯升高，兩者在膿毒癥炎性反應的評估中有重要意義[11]，表明LPS腹腔注射能夠良好地誘導膿毒癥大鼠模型。

右美托咪定是近年臨床常用的鎮靜藥物，因其對血流動力學的影響小、譫妄發生率低等優勢受到臨床醫生的青睞。臨床上，右美托咪定誘導的心率下降較為常見。本研究中發現右美托咪定干預后膿毒癥大鼠脈率有所下降，但低劑量對尾動脈平均動脈壓變化不明顯，有助于維持血流動力學穩定。研究表明，右美托咪定除了有助于減輕膿毒癥大鼠血流動力學的變化外[12]，同時可改善微循環[13]及抑制炎性反應、免疫調節等作用[14]，表現為降低IL-6、IL-8、TNF-α及高遷移率族蛋白B1等炎性介質的含量[4]。在此研究中同樣發現右美托咪定干預后IL-6、TNF-α出現下降，只是高劑量組更加明顯，而低劑量組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labeling)[15]，名為末端轉移酶介導的dUTP末端標記法。通過標記細胞凋亡后出現的DNA末端殘基，在顯微鏡下觀察并計數，從病理組織學角度直觀地評估組織細胞凋亡情況。本研究中發現膿毒癥可增加胃體組織細胞凋亡，低劑量右美托咪定干預后凋亡細胞數減少，高劑量并未得到更好的效果。同樣的變化趨勢也發生在凋亡蛋白Caspase-3及Caspase-9的表達上。半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)家族包括多達10余種Caspase分子，主要是介導細胞內不可逆的凋亡程序[16]。本研究觀察到，膿毒癥大鼠無論是Caspase-9還是Caspase-3較正常大鼠均有明顯增高，DEX藥物干預后，低劑量組較膿毒癥大鼠表現出顯著性Caspase -3蛋白表達下降，而Caspase-9蛋白表達灰度比較，差異無統計學意義(P>0.05)。與此同時，高劑量干預組與膿毒癥大鼠對比未見凋亡蛋白Caspase-9或Caspase-3的表達顯著性差異。推測原因可能是低劑量DEX有助于維持膿毒癥血流動力學穩定及其抗炎、免疫調節作用有關，改善胃體組織細胞局部微循環、減輕炎性反應損傷，從而減少細胞凋亡的發生，而高劑量DEX顯著降低血壓有關，胃組織低灌注帶來的不良后果掩蓋了DEX的抗凋亡保護作用。Caspase家族中Caspase-9負責凋亡程序起始部分，而Caspase-3是最后執行凋亡蛋白之一。至于為什么起始部分的Caspase-9沒有變化而執行者Caspase-3表達明顯降低？筆者給出的推測是DEX在膿毒癥中與Caspase蛋白之間存在另一條啟動程序模式，其中的具體分子作用機制尚不明確，有待進一步研究證實。

綜上所述，腹腔注射脂多糖是一種可靠的膿毒癥造模方式，同時可避免胃體組織創傷性損傷的干擾；膿毒癥大鼠可出現血流動力學改變，低劑量右美托咪定干預后表現為減慢脈率、血流動力學穩定，并通過減少胃體組織細胞Caspase-3蛋白表達而減少凋亡發揮保護作用，而高劑量右美托咪定治療并未見上述的保護作用。