海藻酸鈉基pH響應性聚合物膠束的制備及釋藥性能研究

韓俊源 王玉瓏劉慶堅 劉艷新

（長沙理工大學化學與食品工程學院，湖南長沙，410114）

海藻酸鈉是提取自褐藻或馬尾藻的天然線性多糖，由1-4-α-L-古羅糖醛酸（G段）和1-4-β-D-甘露糖醛酸（M段）組成［1-3］。作為一種資源豐富的天然生物質材料，海藻酸鈉在造紙、食品、醫藥等領域具有廣泛的用途，如造紙行業中用作增強劑［4-6］、表面施膠劑［3，7］、涂布助劑［8］，食品行業中用作穩定劑［9］，醫藥行業中用作黏合劑［10-12］等。以天然多糖為原料，開發新型生物質材料，提高天然產物的應用價值，具有十分重要的意義。近年來，使用天然多聚糖制備智能型藥物載體實現藥物緩釋或控釋成為研究熱點之一。pH響應性聚合物膠束是一種常用的智能型藥物載體，可根據環境pH值的變化選擇性地釋放藥物，實現藥物的靶向控制釋放［13-16］，有效提高藥物生物利用度［17-18］，在組織工程［19-20］、藥物釋放［21-23］和生物傳感器［24-25］等領域具有廣闊的應用前景。

本研究以海藻酸鈉（天然多糖）生物質為基材，采用1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）對海藻酸鈉進行改性并制備海藻酸鈉基pH響應性聚合物膠束（以下簡稱聚合物膠束），分析了EDC/NHS改性前后海藻酸鈉的紅外光譜（FT-IR）及聚合物膠束臨界膠束濃度（CMC）、粒徑和Zeta電位；利用反溶劑重結晶法將疏水藥物金雀異黃酮包裹于聚合物膠束中，并對載藥聚合物膠束的包封率、載藥量和pH響應性進行了研究，以期實現藥物的緩釋和控釋。

1 實驗

1.1 材料與試劑

海藻酸鈉、EDC、NHS、磷酸鹽（PBS）緩沖液、氫氧化鈉、無水乙醇（均為分析純），國藥集團化學試劑有限公司；金雀異黃酮（≥98%純度），成都埃法生物有限公司。

1.2 儀器與設備

Nano ZS90馬爾文激光粒度儀，英國Malvern公司；D＆DN JY99-IIDN超聲波細胞破碎儀，寧波新芝生物科技有限公司；TGL-16G高速離心機，上海安亭科學儀器有限公司；DSM-172熒光光譜儀，上海佰赫貿易有限公司；ALPHA1型真空冷凍干燥機，德國Marin Christ公司；Nicolet iS5型傅里葉紅外光譜儀，美國Thermo Fisher公司；TU-1810（PC）型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 聚合物膠束的制備

稱取0.594 g絕干海藻酸鈉粉末加入到100 mL去離子水中，攪拌至完全溶解，得到海藻酸鈉溶液。稱取0.576 g EDC粉末和0.345 g NHS粉末加入到海藻酸鈉溶液中，在磁力攪拌條件下常溫反應30 min。將反應液滴入到無水乙醇中以析出沉淀，采用離心機離心15 min后得到白色固體析出物，用無水乙醇重復洗滌后過濾。將析出物在真空冷凍干燥機中干燥至質量恒定（25℃），再重新溶于去離子水中以制備聚合物膠束。

1.3.2 載藥聚合物膠束的制備

采用反溶劑重結晶法將金雀異黃酮包裹于聚合物膠束中。稱取金雀異黃酮粉末溶于無水乙醇中，超聲分散15 min，配置得到不同濃度的金雀異黃酮無水乙醇溶液。在磁力攪拌條件下，取2 mL金雀異黃酮無水乙醇溶液逐滴加入40 mL聚合物膠束溶液（5 mg/mL）中；滴加完成后，繼續攪拌10 min，將溶液經0.4μm的微孔濾膜過濾，制備得到載藥聚合物膠束。

1.3.3 性能分析

1.3.3.1 FT-IR分析

采用Nicolet iS5型傅里葉紅外光譜儀對EDC/NHS改性前后海藻酸鈉試樣進行分析，掃描范圍400～4000 cm-1，分辨率為4 cm-1。

1.3.3.2 CMC測定

采用熒光探針法測定聚合物CMC。熒光掃描激發波長為335 nm，激發狹縫為3.0 nm，發射狹縫為2.5 nm，掃描范圍350～450 nm，掃描速度為8 nm/s。1.3.3.3 聚合物膠束粒徑和Zeta電位測定

移取聚合物膠束樣品，加入去離子水稀釋至一定濃度。采用Nano ZS90馬爾文激光粒度儀對不同pH值的樣品進行粒徑、PDI和Zeta電位的測定。

1.3.3.4 聚合物膠束的載藥量和包封率測定

采用紫外分光光度法測定載藥聚合物膠束溶液的吸光度。由金雀異黃酮標準曲線計算聚合物膠束中包載藥物的質量，通過式（1）和式（2）計算聚合物膠束的載藥量和包封率：

式中，m1為聚合物膠束中負載的藥物質量（mg），m2為聚合物膠束的絕干質量（mg），m3為聚合物膠束中投入的藥物質量（mg）。

1.3.4 聚合物膠束pH響應性分析

聚合物膠束的pH響應性分析通過測定其在不同pH值溶出介質中的累計溶出度的方法進行評價，具體實驗步驟參考《中國藥典》（2015年版）附錄XC第二法（槳法）［26-29］。量取含有2 mg金雀異黃酮的載藥聚合物膠束溶液，將其置入透析袋中，分別在pH值為7.4、6.8、5.0、2.0的去離子水中進行溶出實驗，控制水浴溫度為（37±0.5）℃，搖床轉速設定為100 r/min。自透析袋置入溶出介質開始，分別在0.5、1、2、4、6、8、10 h時取樣3 mL，同時補充3 mL等溫新鮮介質。取出的樣品經0.22μm的微孔濾膜過濾，采用紫外分光光度計在波長260 nm下，測定所得濾液中金雀異黃酮的吸光度，并由式（3）計算累計溶出度，繪制金雀異黃酮的溶出曲線。

式中，C1、C2、Cn-1和Cn分別為不同取樣時間時金雀異黃酮的質量濃度（mg/mL），V1為固定的取樣量（mL），V2為溶出介質的總體積（mL），m為加入的金雀異黃酮的總質量（mg）。

2 結果與討論

2.1 EDC/NHS改性海藻酸鈉的化學原理

EDC/NHS改性海藻酸鈉的化學原理如圖1所示。海藻酸鈉含有大量的羧基基團，在水溶性碳二亞胺鹽EDC的存在下，羧基基團被活化，并與EDC上的碳二亞胺鍵反應生成O-酰基異脲中間體，此中間體在水溶液中難以穩定存在，會與NHS迅速反應并轉化成相對穩定的海藻酸鈉的NHS活性酯產物，此活性酯在酸性條件下相對穩定，在中性或堿性條件下易發生斷裂［30-31］。由于EDC/NHS改性的海藻酸鈉聚合物含有親水性基團（羧基）和疏水性基團（NHS活性基團酯），當達到一定濃度時，可在水中自組裝形成具有核-殼結構的聚合物膠束。聚合物膠束的親水外殼可以保持膠束體系的穩定，內核由疏水基團組成，可用于裝載疏水藥物。當環境pH值改變時，聚合物的化學敏感鍵斷裂而引起聚合物膠束破裂，從而將其中的藥物釋放，實現了藥物的緩釋與控釋。

2.2 FT-IR分析

海藻酸鈉和EDC/NHS改性海藻酸鈉的FT-IR譜圖如圖2所示。從圖2可以看出，海藻酸鈉在3340（—OH的伸縮振動）、1625和1408（COO—的反對稱與對稱伸縮振動）、1030 cm-1（C—O—C的伸縮振動）處均出現了特征吸收峰，Kumar等［32］在研究中也報道了相似的結果。與海藻酸鈉的吸收峰相比，EDC/NHS改性海藻酸鈉的FT-IR譜圖在1298 cm-1處出現新的吸收峰（酯鍵中C＝O的吸收峰），表明有新的酯鍵生成。此外，改性海藻酸鈉在1408和1625 cm-1處的COO—的反對稱與對稱伸縮振動吸收峰強度明顯降低，分析認為這是由于COO—參與了反應，生成了新的基團。FT-IR譜圖分析結果表明，EDC/NHS成功改性海藻酸鈉，形成了海藻酸鈉的NHS活性酯。

圖1 EDC/NHS改性海藻酸鈉的技術路線Fig.1 Schematic diagram of EDC/NHS modified sodium alginate

圖2 海藻酸鈉和EDC/NHS改性海藻酸鈉的FT-IR譜圖Fig.2 FT-IR spectra of sodium alginate and EDC/NHS modified sodium alginate

2.3 聚合物CMC

CMC可以作為表征聚合物膠束形成的關鍵性參數和指標［33］。本研究以芘作為熒光探針來測定聚合物的膠束化行為，聚合物膠束lgC值與芘的熒光光譜中第一峰與第三峰強度的比值（I373/I383）關系如圖3所示。

圖3 聚合物膠束lg C值與I373/I383關系圖Fig.3 Relationship between lg C and I373/I383 value of polymer micelle

芘是一種強疏水性的芳香環化合物，而且芘具有的熒光特性主要由其所在環境的極性決定。當聚合物的濃度很低時，芘的熒光光譜中I373/I383為穩定的數值，這是因為此時的聚合物還是以單體的形式存在于水溶液中，芘在極性溶液中分散；隨著聚合物濃度提高（超過CMC），水中的聚合物單體開始聚集形成膠束，疏水性的芘會向膠束的疏水內核中聚集，即開始增溶于聚合物膠束柵欄層的疏水微區中。此時，芘所在的環境由極性轉變為非極性，I373/I383會發生突變，而突變的點即是形成膠束時的濃度。由圖3可得到改性海藻酸鈉的CMC為0.041 mg/mL，表明改性海藻酸鈉在濃度高于0.041 mg/mL時可以形成膠束。

2.4 聚合物膠束粒徑和Zeta電位

聚合物膠束的粒徑、PDI和Zeta電位如表1所示。從表1可以看出，當聚合物膠束溶液的pH值為2.0時，其平均粒徑為220.3 nm，PDI為0.38，表明聚合物膠束粒徑分布均勻，Zeta電位為-38.3 mV，粒子帶負電，穩定性良好。隨著溶液體系pH值升高，聚合物膠束的平均粒徑和PDI逐漸減小，Zeta電位（絕對值）降低。當pH值為7.4時，其平均粒徑降至87.2 nm，PDI為0.19，Zeta電位為-24.9 mV，聚合物膠束體系穩定性降低。分析認為，這是由于隨著溶液pH值提高，NHS活性酯鍵斷裂，從而引起聚合物膠束破裂。

2.5 聚合物膠束的載藥量和包封率

采用反溶劑重結晶法將疏水性藥物金雀異黃酮包裹于聚合物膠束中，其包封率與載藥量如表2所示。從表2可以看出，聚合物膠束包封率隨金雀異黃酮投藥量的增加而逐步降低，而載藥量隨之提高。當聚合物膠束與金雀異黃酮的質量比達到10∶1后，增加金雀異黃酮投藥量并不能顯著提高聚合物膠束的載藥量，而包封率會大幅降低。分析認為，這是由于聚合物膠束的疏水性內核結構空間有限，當聚合物膠束粒子包載一定量的藥物分子后，其余過量的藥物分子較難克服分子間的作用力而進入聚合物膠束內核中。

表1 聚合物膠束的粒徑、PDI和Zeta電位Table 1 Particle size,PDI，and Zeta potential of polymer micelle

表2 聚合物膠束包封率和載藥量的分析Table 2 Analysis of encapsulation rate and drug load of polymer micelle

2.6 載藥聚合物膠束pH響應性

選用聚合物膠束與金雀異黃酮質量比為10∶1制備載藥聚合物膠束，通過分析載藥聚合物膠束在不同pH值溶出介質中金雀異黃酮的累積溶出度來評價載藥聚合物膠束的pH響應性，結果如圖4所示。

圖4 載藥聚合物膠束在不同pH值溶出介質中的藥物溶出度Fig.4 Dissolution of drug-loading polymer micelle in releasing media with different pH value

從圖4可以看出，當溶出介質的pH值為2.0時，包載于聚合物膠束中的金雀異黃酮處于相對穩定狀態，釋放量少，2 h時的溶出度為10.3%，10 h時為18.0%；隨著pH值的升高，金雀異黃酮溶出度快速增加，在pH值為6.8和7.4時，藥物在2 h時的溶出度分別達到64.9%和92.9%，在10 h時溶出度分別達到75.0%和98.9%。這是由于在酸性條件下，聚合物膠束結構穩定，能較好地包載藥物；在中性條件下，聚合物疏水端的pH值敏感酯基發生斷裂，聚合物的兩親性被破壞而引起膠束結構崩解，從而達到藥物釋放的效果。以上結果表明，載藥聚合物膠束具有良好的pH響應性。

3 結 論

本研究以海藻酸鈉生物質為基材，采用1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）/N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）化學改性海藻酸鈉并制備了海藻酸鈉基pH響應性聚合物膠束（以下簡稱聚合物膠束），對所制得的改性海藻酸鈉和聚合物膠束進行了性能表征；利用反溶劑重結晶法將疏水藥物金雀異黃酮包裹于聚合物膠束中，并對載藥聚合物膠束的包封率、載藥量和pH響應性進行了研究，主要研究結論如下。

3.1 經EDC/NHS化學改性后，海藻酸鈉可以形成NHS活性酯聚合物，該聚合物具有親水基團（羧基）和疏水基團（NHS酯基），可在水中形成聚合物膠束，其臨界膠束濃度為0.041 mg/mL。

3.2 聚合物膠束在酸性條件下較為穩定，當pH值為2.0時，其粒徑為220.3 nm，Zeta電位為?38.3 mV，聚合物膠束溶液穩定性良好。當體系pH值升高至7.4（中性）時，聚合物膠束穩定性降低，粒徑變小。

3.3 聚合物膠束與金雀異黃酮的質量比影響載藥膠束的包封率和載藥量，高的投藥量有助于提升載藥量，但明顯降低包封率；當聚合物膠束與金雀異黃酮質量比為10∶1時，載藥聚合物膠束具有較高的包封率和載藥量，分別為74.4%和8.6%。

3.4 體外溶出實驗表明，載藥聚合物膠束具有良好的pH響應性，在pH值為2.0的溶出介質中，載藥聚合物膠束相對穩定，藥物溶出度小，而在pH值為6.8或7.4的溶出介質中，載藥聚合物膠束大量釋放藥物（溶出度大），這是因為改性海藻酸鈉聚合物中NHS活性酯鍵在酸性條件下相對穩定，但在中性條件下易斷裂。該類聚合物膠束有望作為口服型腸吸收藥物的載體，實現藥物的控釋和緩釋，提高藥物利用度。