長期施肥對紅壤稻田土壤微生物生物量和酶活性的影響*

夏文建，柳開樓，張麗芳，劉 佳，葉會財，鄧國強，李大明，李祖章，王 萍，李 瑤，楊成春，彭春瑞，陳 金?

（1. 江西省農業科學院土壤肥料與資源環境研究所/農業農村部長江中下游作物生理生態與耕作重點實驗室/國家紅壤改良工程技術研究中心，南昌 330200；2. 江西省紅壤研究所，南昌 330046）

在農田生態系統養分循環中，土壤胞外酶活性（extracellular enzyme activities，EEAs）與土壤功能密切相關，能夠反映土壤養分狀況，是表征土壤肥力和土壤質量的重要指標之一[1-2]。同時，土壤胞外酶活性與土壤微生物活動密切相關，可以較為全面地反映土壤微生物群落的功能特征，在土壤生態系統和土壤質量評價中受到廣泛關注[3]。施肥[4-5]，特別是氮[6-7]、磷[8]等養分投入對土壤酶活性的影響已有較多研究，一般認為養分的投入會增加土壤微生物生物量，刺激微生物產生對應的酶，引起土壤胞外酶活性的增加，尤其以化肥和有機肥配施的效果最佳[9-11]。

魏亮等[12]研究了水稻不同生育期根際與非根際EEAs對施氮的響應，發現根際和非根際影響胞外酶活性的因素不同，土壤酶活性與多種環境因子存在復雜關系。在長期不同比例有機肥替代化肥的試驗條件下，土壤碳氮比是影響EEAs的主要因素之一[13]。而長期施用化肥和不同有機肥處理條件下，EEAs與水溶性有機碳之間有更強的相關性[14]。調控物質循環的水解酶或氧化還原酶活性受到了對應的土壤養分狀況影響[14-15]。然而，由于供試土壤和試驗環境的差異，不同研究者所獲得的研究結果不盡一致。現有研究更關注長期施肥對土壤養分和微生物群落的影響[16]，對于土壤生物活性和功能研究相對較少，或者僅選擇2～3種土壤胞外酶描述土壤功能[8，12]，關于長期施肥對土壤碳、氮、磷等養分物質循環相關胞外酶活性總體分布特征的研究不多。土壤胞外酶活性可以較為全面地指示土壤生境變化和生態功能特征，且對土壤環境變化敏感[1，17]。因此，開展長期施肥土壤胞外酶活性特征及與環境因子的關系研究，對于深入理解碳、氮、磷等養分物質循環過程具有重要意義[17-18]。

為了研究長期施肥對紅壤稻田土壤胞外酶活性（EEAs）的影響及其驅動因子，本文利用持續了37 a的長期定位試驗，采用微孔板熒光法測定了土壤α-葡萄糖苷酶（AG）、β-葡萄糖苷酶（BG）、纖維素水解酶（CBH）、乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAG）、酸性磷酸酶（ACP）和酚氧化酶（POX）等6種酶，涵蓋了土壤C、N、P等養分循環和有機物氧化，同時分析了土壤化學指標和土壤微生物生物量碳氮，通過主成分分析和冗余分析探討土壤胞外酶分布特征及其與土壤養分和微生物生物量的關系，以期解析長期施肥影響EEAs特征的關鍵因子，為紅壤稻田肥力培育提供微生物酶學方面的理論參考。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

紅壤稻田長期定位試驗位于進賢縣張公鎮江西省紅壤研究所（116°20′24″N、28°15′30″E）。平均海拔30 m，屬中亞熱帶季風氣候，年均氣溫17.6 ℃，有效積溫5 528 ℃；年降水量1 785 mm，無霜期約280 d，日照時數1 950 h。

長期定位試驗始于1981年[19]，種植制度為雙季稻。供試土壤為第四紀紅色黏土發育的水稻土。試驗前土壤耕層基礎肥力狀況為：土壤pH 6.9，有機碳16.3 g·kg-1，全氮1.49 g·kg-1，全磷0.48 g·kg-1，全鉀10.39 g·kg-1，堿解氮150.4 mg·kg-1，有效磷4.15 mg·kg-1，速效鉀80.52 mg·kg-1。

1.2 試驗設計

本研究選擇長期定位試驗中的4個處理，分別為：不施肥（CK）、化肥（NPK）、2倍氮磷鉀（HNPK）和氮磷鉀+有機肥（NPKM）。小區面積46.67 m2，3次重復。每季施肥量：氮肥純N 90 kg·hm-2，磷肥P2O545 kg·hm-2，鉀肥K2O 75 kg·hm-2，有機肥22 500 kg·hm-2。肥料品種氮肥為尿素，磷肥為鈣鎂磷肥，鉀肥為氯化鉀。有機肥早稻為紫云英，晚稻為豬糞。根據多年結果計算[19-20]，紫云英和豬糞帶入的純氮、P2O5、K2O分別為27 kg·hm-2、17.0 kg·hm-2、28.5 kg·hm-2和 33.8 kg·hm-2、58.0 kg·hm-2、33.9 kg·hm-2。氮肥60%作基肥，剩下的40%于水稻返青后作追肥施用；鉀肥全部于水稻返青后作追肥施用；磷肥和有機肥全部作基肥。所有小區的播種、移栽、灌溉和打藥等日常管理措施與當地習慣相同。

1.3 研究方法

2017年晚稻收獲后，每小區S型采集0～20 cm耕層土壤樣品。按四分法分出1/2鮮樣分析土壤胞外酶活性和微生物生物量，剩余1/2樣品攤勻風干，磨細過篩分析土壤理化性質。水稻產量為周年早稻和晚稻產量之和，由小區實測產量換算。

土壤化學性質采用常規實驗方法測定[21]：土壤pH（2.5︰1）采用酸度計電位法；土壤有機碳（SOC）采用重鉻酸鉀外加熱法測定。全氮（TN）用半微量凱氏法測定；全磷（TP）用堿熔－鉬銻抗比色法測定；堿解氮（AN）用堿解擴散法測定；有效磷（AP）用Olsen法測定；速效鉀（AK）用1 mol·L-1NH4OAc浸提－火焰光度法測定。土壤微生物生物量碳（MBC）和微生物生物量氮（MBN）采用氯仿熏蒸培養法測定[22]。

土壤胞外酶活性采用96微孔酶標板熒光分析法測定[23]。AG、BG和CBH催化葡萄糖和纖維素水解，是與土壤碳循環有關的酶；NAG催化幾丁質和肽聚糖水解，是與土壤氮循環有關的酶；ACP催化有機磷水解，是與土壤磷循環有關的酶；POX催化酚類物質氧化，是與土壤腐殖化過程等相關的酶[16，24]。用甲基傘形酮（4-methylumbelliferyl，4-MUB）作為底物標示水解酶活性，用 L-二羥苯丙氨酸（L-3,4-dihydroxyphenylalanine，L-DOPA）為底物標示酚氧化酶（POX）活性，利用多功能酶標儀在激發波長365 nm、發射波長450 nm的條件下測定。測定的6種土壤胞外酶的名稱、縮寫、功能、底物和國際酶學委員會編碼（EC編碼）見表1。

表1 土壤胞外酶名稱、縮寫、所用底物和國際酶學委員會編碼Table 1 Names，abbreviations，substrates used and International Enzyme Commission number of the soil extracellular enzymes involved in the study

1.4 數據處理

試驗數據用Excel 2016整理、計算和繪圖，圖表數據為平均值和標準誤（SE），運用SPSS 17.0進行相關性分析、單因素方差分析和差異顯著性檢驗（最小顯著差異（LSD）法，P＜0.05）。采用Canoco 5.0軟件進行主成分分析（PCA）和冗余分析（RDA）。

2 結 果

2.1 長期施肥對土壤化學性質和水稻產量的影響

經過37 a的長期不同施肥處理，土壤化學性質和水稻產量發生了顯著變化（表2）。與CK處理相比，NPK處理顯著提高了土壤SOC、AN和AP含量，HNPK處理顯著提高了土壤SOC和氮、磷、鉀養分含量；與NPK處理相比，HNPK處理顯著提高了土壤TP、AP和AK；而NPKM處理與HNPK處理相比，顯著提高了SOC和氮、磷、鉀等養分含量。與CK處理相比，施肥處理土壤pH均有所下降，但未達到顯著水平。各施肥處理周年水稻產量較CK處理增加了81.4%～158.4%。

表2 長期施肥下的土壤化學性質和水稻產量Table 2 Soil chemical properties and rice yield of the paddy fields under long-term fertilization

2.2 長期施肥對土壤微生物生物量的影響

長期施肥土壤MBC和MBN呈增加的趨勢（圖1）。NPK處理土壤MBC和MBN較CK處理增加了20.8%和33.6%；與CK相比，HNPK和NPKM處理顯著提高了土壤MBC和MBN（P＜0.05），其中，HNPK處理土壤MBC和MBN分別增加了41.1%和42.9%，NPKM處理則分別增加了60.2%和60.4%。

2.3 長期施肥對土壤胞外酶活性的影響

長期施肥改變了土壤EEAs狀況（表3），不同土壤胞外酶對施肥的響應存在差異。與不施肥（CK）相比，NPK處理顯著提高了AG和NAG活性；HNPK處理顯著提高了AG和NAG活性，顯著降低了ACP和POX活性；NPKM處理AG、BG、NAG和ACP活性分別提高12.7%、41.1%、36.2%和50.0%，POX活性顯著下降29.7%（P＜0.05）。各施肥處理CBH活性略有增加，但處理之間差異均不顯著。

表3 長期施肥下的土壤胞外酶活性Table 3 Activities of soil extracellular enzyme as affected by long-term fertilization

2.4 土壤胞外酶活性與土壤化學性質、微生物生物量和水稻產量的相互關系

土壤EEAs與土壤化學性質、微生物生物量和水稻產量的相關分析（表4）結果顯示，土壤NAG活性與土壤微生物生物量（MBC和MBN）和水稻產量之間相關性達到顯著水平，但與土壤養分之間相關性不顯著；土壤BG活性與土壤SOC和氮、磷養分（TN、TP、AN和AP）之間相關性達顯著水平；土壤CBH活性與土壤TN、MBC和速效養分（AN、AP和AK）之間相關性達顯著水平；土壤ACP活性與土壤TN、AN、AP之間相關性達顯著水平；土壤POX活性與除pH外的各指標均呈極顯著負相關，而AG與各指標間相關性均不顯著。可見，土壤EEAs受到了土壤養分和微生物影響，但不同胞外酶對土壤養分的響應存在較大差異。

2.5 土壤胞外酶活性分布特征及關鍵驅動因子

通過對6種土壤EEAs進行主成分分析，前兩個主成分共包含了土壤EEAs分布特征的87.8%（圖2）。長期不同施肥使EEAs分布產生差異，CK處理分布于上方中間部位，NPK處理分布在中心原點附近，HNPK處理主要分布在右下方，而NPKM處理主要分布在左下方。以土壤EEAs為響應變量，土壤化學性質、微生物生物量為解釋變量進行RDA分析（圖3）。RDA前兩個排序軸保留了土壤胞外酶活性數據總方差的86.8%，即9個環境因子在前兩軸中累計解釋了土壤胞外酶活性特征的86.8%。響應變量與解釋變量之間的箭頭夾角的余弦值可以表示兩者之間的相關性[25]，RDA排序圖可以看出TN、AN、AP與BG、CBH、ACP之間呈正相關關系，MBC和MBN與NAG相關性較高，而土壤養分和微生物生物量與POX之間呈負相關關系，該結果與相關分析（表4）的結果一致。

表4 土壤胞外酶活性與土壤化學性質、微生物生物量和水稻產量的相關性Table 4 Correlations analysis of soil extracellular enzyme activities with soil chemical properties，microbial biomass and grain yield

各試驗處理點在RDA圖上的分布及與響應變量（EEAs）的位置關系可以看出，不施肥（CK）處理POX活性較高，NPKM處理主要提高了ACP、BG和CBH活性，HNPK處理主要提高了AG和NAG活性，而NPK處理胞外酶活性處于居中的位置。土壤EEAs的變化主要由土壤養分狀況驅動，其中土壤全氮（TN）和微生物生物量碳（MBC）分別解釋了方差變異的34.3%和20.9%，達到顯著水平，表明長期施肥引起土壤酶活性的變化可以由TN和MBC這兩個參數來解析。

3 討 論

3.1 長期施肥對紅壤稻田土壤養分和微生物生物量的影響

稻田長期均衡施用氮磷鉀肥以及氮磷鉀肥與有機肥配施有利于土壤肥力的提升，長期化肥配施有機肥使土壤SOC、TN、TP、AN和AP等養分顯著增加[26]。本研究發現，與低量氮磷鉀肥（NPK）相比，提高化肥用量（HNPK）對SOC、TN和AN的增加不顯著，而有機無機配施（NPKM）顯著提高了土壤有機碳和氮、磷、鉀養分含量（表2），表明有機無機配施對于提升土壤養分具有更佳效果。Meta大數據分析也有相似的結論，與化肥處理相比，有機肥或有機無機配施處理作物產量平均增加27%、SOC增加38%、TN增加20%[11]。

土壤微生物生物量代表了參與土壤中養分循環和有機物質轉化的微生物數量[27]，土壤MBC和MBN轉化迅速，是敏感的土壤質量指標[27-28]，施用化肥可以提高土壤MBC和MBN。在不同利用方式土壤中的統計結果顯示，與不施肥相比，長期施用化肥農田土壤MBC增加15.1%[2]，稻田土壤MBC和MBN分別增加26%和13%[10]；而有機肥投入具有更加顯著的提升效果，與化肥處理相比MBC和MBN分別增加51%和24%[11]。本研究發現，與CK相比，NPK、HNPK和NPKM處理MBC分別增加20.8%、41.1%和60.2%，MBN分別增加33.6%、42.9%和60.4%（圖1），表明土壤微生物生物量隨化學肥料投入量在一定用量范圍內呈遞增趨勢，而有機無機配施（NPKM）提升效果更為明顯。

3.2 長期施肥對紅壤稻田土壤胞外酶活性的影響

土壤胞外酶是土壤生態系統養分循環和代謝的主要驅動力，胞外酶活性反映了土壤的生物活性和生化反應的活躍程度[1-3]。土壤胞外酶活性對土壤環境因素敏感，不同研究者在不同區域和土壤上的研究結果存在較大差異。紅壤旱地長期施用化肥或化肥與有機肥配施可以顯著提高參與碳循環（BG、CBH）和氮循環（NAG）相關的水解酶活性[29-30]；稻田土壤施用化肥使參與碳循環水解酶BG活性較對照提高了35%～118%，參與氮循環水解酶NAG活性較對照提高了9%～30%[31]；而化肥配施有機肥可以進一步提高BG和NAG活性[31-32]。Meta分析也有相似的結論，化肥投入可增加AG、BG、CBH、NAG等酶活性[6，9]，有機肥投入促使相關酶活性大幅增加[11]。本研究發現長期施用化肥（NPK和HNPK）或有機無機配施（NPKM）提高了稻田土壤SOC和MBC（表2，圖1），從而促進了AG、BG和CBH等碳循環相關水解酶的活性（表3）；施用化肥增加了土壤氮素養分含量（TN、AN和MBN）（表2，圖1），提高了氮循環有關的NAG活性（表3），而有機無機配施（NPKM）處理土壤有效氮含量大幅增加，消減了土壤微生物代謝對氮素限制，使氮水解酶的分泌降低，導致NAG活性較高量化肥（HNPK）處理有所降低；低量氮磷鉀（NPK）處理提高了土壤ACP活性，而高量氮磷鉀（HNPK）處理降低了土壤ACP活性（表3），這可能由于高量無機磷投入抑制了解磷菌活性和酸性磷酸酶的合成與分泌，從而導致ACP活性下降[33-34]，而有機無機配施（NPKM）處理施用紫云英和豬糞，提供了豐富的碳源和有機磷，顯著提高了ACP活性[35-36]。酚氧化酶（POX）參與木質素的降解與腐殖化過程[17]，榮勤雷等[32]長期有機培肥的數據顯示不同肥料品種對土壤POX的影響存在差異，與不施肥相比，化肥配施畜禽糞便POX活性略有提高，單施化肥及化肥與綠肥或秸稈配施土壤POX活性均顯著降低。長期定位研究發現，施用化肥或有機肥顯著降低POX活性[14，16]；而Zhang等[37]在稻田短期試驗的研究結果卻顯示增施有機肥提高了POX的活性，這可能與稻田有機物料腐解產生的還原物質短期內引起土壤微生物的響應有關。本研究中POX活性隨化肥用量增加而下降，有機無機配施POX活性最低（表3），與前人研究結果[32-36]基本一致。

3.3 紅壤稻田土壤胞外酶活性分布特征及其驅動因子

本研究通過對碳（AG、BG、CBH）、氮（NAG）、磷（ACP）循環相關的水解酶和氧化酶（POX）進行主成分分析，發現長期不同施肥處理造成土壤養分發生顯著變化，從而顯著影響了土壤EEAs的分布特征（圖2）。土壤EEAs與養分之間存在典型相關關系[31]，EEAs的變化趨勢與微生物生物量、有機碳和全氮的變化趨勢基本一致[30]。Allison和Vitousek[38]研究認為微生物胞外酶的合成符合經濟學理論，當微生物營養受到限制時會激發相應酶的分泌，而且土壤胞外酶活性與對應的功能基因數量有很強的相關性，兩者之間的關系受到了土壤微生物結構、土壤有機碳、pH等調控[3]，但在不同土壤環境條件下，土壤EEAs的主要影響因素存在一定差異。本研究通過土壤EEAs與環境因子的RDA分析發現，EEAs的變化主要由土壤TN和MBC驅動，分別解釋了酶活性變異的34.3%和20.9%（圖3），表明氮素和有機物投入是影響紅壤性稻田土壤EEAs的關鍵因素。

4 結 論

長期施肥顯著影響了紅壤性水稻土養分狀況和微生物生物量碳氮，從而影響土壤胞外酶活性（EEAs），其中土壤全氮（TN）和微生物生物量碳（MBC）是關鍵的決定因子，分別解釋了酶活性變異的34.3%和20.9%。化肥配施有機肥有利于水稻增產，并提高土壤養分、微生物生物量和土壤碳、氮、磷循環相關水解酶活性，是維持作物高產和提升土壤質量最優的施肥管理措施。土壤胞外酶活性EEAs是土壤質量的敏感指標，但土壤EEAs與環境因子之間關系、長期施肥對EEAs特征的影響及有關機制尚待進一步研究，特別是深入研究不同培肥措施引起的土壤胞外酶活性與土壤微生物數量、結構和功能變化之間的關系。

致 謝 感謝江西農業大學榮勤雷博士和江蘇太湖地區農業科學研究所施林林博士在數據分析上給予的幫助。