青海不同產地羌活紅外光譜分析

李美雎，劉 葉，尚 軍，陳海娟

(青海師范大學生命科學學院，青海 西寧 810008)

羌活(Notopterygiumincisum)的主要藥效成份是揮發油和香豆素類，李兆奎等[1]運用紅外光譜方法對鐵皮石斛和幾種常用的混淆品進行了對比分析，可以迅速、準確的將幾種藥品區分開。劉明地等[2]采用紅外光譜法對枸杞藥材進行測定質量。陳燕等[3]為了提高羌活的質量標準，使用高效液相色譜測定分析；吳方斌等[4]用傅里葉變換紅外光譜技術測定羌活、寬葉羌活的根莖和根藥材的一維紅外光譜和二維相關紅外光譜，通過計算二階導數光譜，定量測定峰的強度，并進行光譜解析、主成分分析快速鑒別羌活和寬葉羌活兩種基原植物藥材，實驗結果表明羌活與寬葉羌活一維紅外光譜的特征峰不同，可鑒別羌活和寬葉羌活。沈亮等[5]測定羌活種子在4 000～400 cm-1范圍內的吸收峰，然后將紅外光譜法與SIMCA模式識別法和系統聚類法相結合并快速、準確地將羌活種子鑒別出來。羌活喜涼爽陰濕、耐寒、怕強光，適于寒冷濕潤氣候，青海省的海東地區(主要是化隆縣、互助縣柏門峽、循化縣、民和縣、大通縣)，果洛州(主要是久治、達日、班瑪縣和瑪可河、軍工地區)等地均有羌活和寬葉羌活分布[6，7]。紅外光譜已經成為了中藥化學成分組成、結構、含量研究的重要方法，是中成藥、中藥炮制、中藥材鑒別分析的有效手段，在中藥定量檢驗及定性鑒別中的應用價值得到公認。目前，關于青海不同產地羌活紅外指紋圖譜構建尚未報道。

1 研究方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 傅立葉變換紅外光譜儀 美國Perkin Elmer公司Spectrum Two。

電子天平METTLER TOLEDO(XP205 DeltaRange)。

YP-2壓片機 上海山岳科學儀器有限公司。

1.1.2 藥品與藥材 溴化鉀(KBr，光譜純)碎晶購于天津博君科技有限公司。

實驗用羌活采挖于青海省互助、瑪可河、紅軍溝、久治、松多、大通、班瑪等地且均經尚軍副教授鑒定；羌活對照藥材采購于九康中藥市場。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 將樣品進行粉碎、研磨，過150目篩，放置烘箱中60 ℃恒溫干燥至恒重，將樣品粉末與溴化鉀碎晶進行制品 ，溴化鉀空白片作為對照。

1.2.2 儀器測試條件 一維紅外光譜的掃描范圍為4 000～400 cm-1，每張光譜累加掃描64次，分辨率為4 cm-1，掃描過程中實時扣除二氧化碳和水蒸氣干擾。

1.2.3 精密度的測定 將采于互助北山的樣品連續測定5次，所得紅外光譜圖的相關系數為0.999，RSD值為0.000%，表明儀器精密度良好。

1.2.4 重復性試驗 將采于互助北山的樣品，按供試品制備方法平行制備5份，分別測定，所得紅外光譜圖的相關系數為0.962，RSD值為2.390%，表明方法重復性良好。

1.2.5 紅外光譜的測定 先將溴化鉀空白片置于紅外光譜儀中，掃描，得空白背景片的一維紅外光譜。再將樣品片置于紅外光譜儀中，掃描，得到樣品片的一維紅外光譜。

1.2.6 一維紅外光譜的歸一化 將樣品收集得到的一維紅外光譜經坐標轉化(縱坐標為吸光度)，基線校正，光譜歸一化，得到標準圖譜。儀器自動識別峰的閾值設為0.01 A(峰強)。

1.2.7 二階導數光譜計算 對已歸一化的一維紅外光譜進行二階導數計算，13點平滑，即得二階導數光譜。儀器自動識別峰的閾值設為0.0005 A(峰強)。

2 結果與分析

2.1 不同產地羌活一維譜及相關性分析

由表1可知，久治產羌活與紅軍溝、大通產羌活相比化學成分差異較小，相關系數在0.900以上，與其他地方產羌活相比化學成分差異較大，相關系數在0.900以下；紅軍溝產羌活與瑪可河、班瑪產羌活相比化學成分差異較大，相關系數在0.900以下，與其他地方產羌活相比化學成分差異較小，相關系數在0.900以上；大通產羌活與瑪可河、班瑪產羌活相比化學成分差異較大，相關系數在0.900以下，與其他地方羌活相比化學成分差異較小，相關系數在0.900以上；瑪可河產羌活與其他地方的羌活相比化學成分差異較大，相關系數在0.900以下；松多產羌活與久治、瑪可河、班瑪產羌活相比化學成分差異較大，相關系數在0.900以下，與其他地方的羌活相比化學成分差異較小，相關系數在0.900以上；互助產羌活與久治、瑪可河、班瑪產羌活相比化學成分差異較大，相關系數在0.900以下，與其他地方的羌活相比化學成分差異較小，相關系數在0.900以上。

表1 青海不同產地羌活相關系數測定結果

不同產地羌活植物的一維紅外光譜相似，主要吸收峰位于3 424～3 392、2 928～2 925、2 857～2 854、1 747～1 737、1 628～1 627、1 516～1 513、1 460～1 428、1 378、1 268～1 257、1 157、1 072～1 031、773、576～529、472 cm-1等處(圖1)。其中，3 424～3 392 cm-1為羥基伸縮振動吸收峰；2 928～2 925 cm-1為亞甲基C-H反對稱伸縮振動吸收峰；2 857～2 854 cm-1為亞甲基C-H對稱伸縮振動吸峰；1 747～1 737 cm-1為酯羰基C=O伸縮振動吸收峰；1 628～1 627 cm-1為C=O或C=C伸縮振動吸收峰(包括由蛋白質中C=O伸縮振動和N-H彎曲振動產生的酰胺Ⅰ帶)；1 516～1 513 cm-1為苯環骨架振動吸收峰；1 460～1 428和1 378 cm-1可能為C-H彎曲振動吸峰；1 268～1257、1 157、1 072～1 031 cm-1為C-O伸縮振動吸收峰；950 cm-1以下為苯環的骨架振動峰。

圖1 羌活一維疊加圖

2.2 不同產地羌活二階導數光譜的比較

由于在1 800 cm-1之前會受-OH的影響，而800 cm-1之后基線漂移過大，故選擇1 800～800 cm-1范圍內的羌活(如圖2)進行分析。在羌活二階導數光譜中使用垂直光標標記，顯示1 746、1 628、1 605、1 580、1 545、1 515、1 469、1 457、1 446、1 157、1 130、1 076、988 cm-1是幾個地方羌活的共同峰。

圖2 羌活植物的二階導數疊加圖

2.3 羌活主成分分析

將羌活一維紅外光譜經吸光度轉換、基線校正及歸一化后，以吸光度為量化指標進行主成分分析。

由于3 400～2 800 cm-1波數處受測試環境水分的影響較大，缺乏特征性，而800～400 cm-1波數處基線不穩，也缺乏特征性。故選取紅外光譜測試中特征表達穩定的1 800～800 cm-1波數處作為羌活主成分分析特征波數區間，選取不同產地的羌活紅外一維譜在1 741、1 628、1 516、1 453、1 377、1 265、1 037 cm-1的7個共有峰，以吸光度為指標進行主成分分析。其KMO值為0.7，p=0.00，說明所選7個共有峰適宜做主成分分析，結果如表2，第一主成分累計方差為90.579%，第二主成分累計方差為6.955%，說明前兩個主成分即可解釋7個紅外吸收峰變異的97.534%，即前兩個主成分可以利用資料量的97.534%；經旋轉成分矩陣計算因子最終的得分后，進一步計算各產地羌活化學成分累積量綜合得分，結果如表3所示，不同產地羌活累積化學成分含量具有明顯差異，其特征表現為班瑪羌活>羌活對照藥材>紅軍溝羌活>瑪可河羌活>大通羌活>久治羌活>互助羌活>松多羌活。

表2 解釋的總方差

圖3 旋轉空間中的成分圖

表3 成分因子得分變量

2.4 聚類分析

將羌活一維紅外光譜經吸光度轉換、基線校正及歸一化后，以吸光度為量化指標進行聚類分析。

羌活樣品的主要吸收峰共6個數據點，即相對應的吸收峰A值，SPSS17.0軟件進行聚類分析，結果如圖4所示。從系統聚類分析圖可以看出，可以將青海不同產地羌活分為兩大類，久治、互助、大通、松多、瑪可河產的歸為一類，紅軍溝、班瑪產的歸為一類。

圖4 不同產地羌活聚類分析圖

3 討論

通過紅外光譜技術測定化合物在4 000～400 cm-1的特征吸收峰對其進行定性分析，紅外吸收峰吸光度的高低反應了含量高低。由于中藥材產地不同，其次生代謝產物在結構類型及有效成分含量方面均存在一定的差異性，通過測定中藥材紅外指紋圖譜，在宏觀上可反應中藥化學成分類型及相互關系，并通過不同產地間中藥材一維紅外指紋圖譜及二階導數光譜的峰形、出峰位置及相關系數進行分析，找出相互間的關系，所建圖譜指紋性強，方法簡單、分析速度快、靈敏度強。在一維紅外圖譜的基礎上，經吸光度轉化、基線校正和歸一化，由于在1 800 cm-1之前會受-OH的影響，而800 cm-1之后基線漂移過大，選擇1 800～800 cm-1范圍進行分析，以特征峰吸光度為量化指標，選擇特征性強的共有特征峰進行主成分分析和聚類分析，評定中藥材化學成分累積量，建立以中藥材化學物質為基礎的中藥質量評價標準及不同產地間中藥材的化學成分累積量品質關系評價。

但由于中藥材化學成分復雜，藥理活性物質基礎不明，僅建立以化學物質為特征的指紋圖譜，還無法滿足中藥材“譜—效”關系的質量控制要求。

目前，現行2015版《中華人民共和國藥典》羌活項下收載品種有羌活和寬葉羌活，其質量控制指標以測定羌活醇、阿魏酸苯乙醇酯、異歐前胡素及鐮葉芹二醇含量為其指控標準，并規定羌活醇和異歐前胡素的總量不得少于0.40%，而對二者之間的含量變化關系未作要求。實驗通過構建青海7個產地羌活整體紅外指紋圖譜，定性定量的分析了青海7個不同產地羌活品質及相互關系。結果表明：7個產地的羌活樣品中有7個共有峰，化學成分累積量從高到低依次為班瑪、紅軍溝、瑪可河、大通、久治、互助、松多產羌活，且不同產地的羌活一維紅外圖譜及二階導數光譜均存在一定差異，說明青海7個不同產地羌活所含化學成分的種類及含量存在一定差異，且即便是化學成分類型相似，但化學成分累積量也存在一定差異，進而影響其品質的差異。通過紅外光譜一維和二階導數圖光譜的構建，結合主成分分析與聚類分析可以定量、定性對羌活進行系統的質量評價。