咖啡酰奎寧酸類化合物抑菌活性的網絡藥理學研究

朱文卿，李玲玉，張 利，左兆河，鄭振佳，馬 越

（1.北京市農林科學院蔬菜研究中心，果蔬農產品保鮮與加工北京市重點實驗室，農業農村部蔬菜產后處理重點實驗室，北京 100097；2.山東農業大學食品科學與工程學院，山東省高校食品加工技術與質量控制重點實驗室，山東泰安 271018；3.山東中平藥業有限公司，山東臨沂 273300；4.山東益得來生物科技有限公司，山東泰安 271000）

細菌感染是由皮膚或體內有害細菌菌株的繁殖引起的，可引起肺炎、腦膜炎、皮膚感染、呼吸道感染以及食物中毒等問題[1]。常見的金黃色葡萄球菌、巨大芽孢桿菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希氏菌等是導致人類嚴重感染的常見細菌[2]。細菌不斷地對抗菌藥物表現出抗性使抗生素的運用面臨著挑戰，因此從天然產物中尋找具有抗菌活性的化合物，對開發新型抑菌產品具有重要意義[3]。

咖啡酰奎寧酸類化合物是植物體內重要的次生代謝產物[4]，廣泛存在于中草藥及蔬菜水果中[5]，具有抗菌消炎、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等多種生物活性[6?7]。研究表明，咖啡酰奎寧酸類化合物具有廣譜抗菌活性，對金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、大腸桿菌、白色念珠菌、肺炎鏈球菌等多種致病細菌和真菌均有良好的抑制和殺滅作用[8?14]，具有開發成新型抑菌藥物的潛力。但目前咖啡酰奎寧酸類化合物抑菌的作用靶點和作用機制尚不清楚，這在一定程度上限制了其進一步推廣與應用。

網絡藥理學作為一門新興學科，將藥理學、生物信息學、計算機科學等多門學科相結合，可以揭示“活性成分-基因-靶點-疾病”之間復雜的網絡關系，探索藥物與疾病相關性，從系統水平上研究藥物作用機制與規律，其系統性、整體性符合中藥多組分、多靶點協同作用的特點，被廣泛應用于醫學、藥學等領域[15?17]。分子對接是依據酶的鎖-鑰匙原理，從已知結構的化合物及蛋白出發，通過計算機模擬、化學計量學計算，識別并預測受體-配體結合的方法，預測蛋白質復合物結構和結合位點[18?19]。目前已有研究采用網絡藥理學方法來探究某些中藥成分的抑菌作用機制[20?22]，但關于咖啡酰奎寧酸類化合物抑菌作用的研究還較為缺乏。為深入探討咖啡酰奎寧酸類化合物抑菌的作用機制，本研究基于網絡藥理學方法，借助中藥系統藥理學數據庫和分析平臺，預測咖啡酰奎寧酸類化合物對應靶點與抑菌作用機制，并通過分子對接進行驗證，以揭示咖啡酰奎寧酸類化合物抑菌的科學內涵，為抑菌藥物的研發提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 咖啡酰奎寧酸類化合物信息

38 種咖啡酰奎寧酸類化合物網絡靶點分析順序如下：1-O-咖啡酰奎寧酸（C1）、3-O-咖啡酰奎寧酸（C2）、4-O-咖啡酰奎寧酸（C3）、5-O-咖啡酰奎寧酸（C4）、3-O-咖啡酰奎寧酸甲酯（C5）、3-O-咖啡酰奎寧酸乙酯（C6）、3-O-咖啡酰奎寧酸丁酯（C7）、4-O-咖啡酰奎寧酸甲酯（C8）、4-O-咖啡酰奎寧酸丁酯（C9）、5-O-咖啡酰奎寧酸甲酯（C10）、5-O-咖啡酰奎寧酸丁酯（C11）、1,3-O-二咖啡酰奎寧酸（C12）、1,4-O-二咖啡酰奎寧酸（C13）、1,5-O-二咖啡酰奎寧酸（C14）、3,5-O-二咖啡酰奎寧酸（異綠原酸A）（C15）、3,4-O-二咖啡酰奎寧酸（異綠原酸B）（C16）、4,5-O-二咖啡酰奎寧酸（異綠原酸C）（C17）、3,4-O-二咖啡酰奎寧酸甲酯（C18）、3,5-O-二咖啡酰奎寧酸甲酯（C19）、4,5-O-二咖啡酰奎寧酸甲酯（C20）、4,5-O-二咖啡酰奎寧酸乙酯（C21）、4,5-O-二咖啡酰奎寧酸丁酯（C22）、3,5-O-二咖啡酰奎寧酸丁酯（C23）、3,5-O-二咖啡酰奎寧酸異丁酯（C24）、3,5-O-二咖啡酰奎寧酸乙酯（C25）、1,5-O-二咖啡酰-3-O-（4-蘋果酰）-奎寧酸（C26）、1,5-O-二咖啡酰-3-O-（4-蘋果酸甲酯）-奎寧酸（C27）、1,5-O-二咖啡酰-3-O-（4-丙二酰）-奎寧酸（C28）、1,5-O-二咖啡酰-3-O-琥珀酰奎寧酸（C29）、1,5-O-二咖啡酰-4-O-琥珀酰奎寧酸（C30）、1,5-O-二咖啡酰-4-O-琥珀酸甲酯奎寧酸（C31）、1,4-O-二咖啡酰-3-O-琥珀酰甲酯奎寧酸（C32）、1,3-O-二咖啡酰-4-O-蘋果酰奎寧酸（C33）、1,3,5-O-三咖啡酰奎寧酸（C34）、1,4,5-O-三咖啡酰奎寧酸（C35）、3,4,5-O-三咖啡酰奎寧酸（C36）、3,4,5-O-三咖啡酰奎寧酸甲酯（C37）、1,3,4,5-O-四咖啡酰奎寧酸（C38）。咖啡酰奎寧酸類化合物的特征結構如圖1 所示。

圖1 咖啡酰奎寧酸類化合物的特征結構Fig.1 The characteristic structure of caffeoylquinic acids

1.2 咖啡酰奎寧酸類化合物對應靶點預測

采用Pubchem數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）及ChemDraw Ultra 8.0.3 軟件獲取咖啡酰奎寧酸類化合物的SMILES結構，并將化合物的SMILES結構導入SwissTargetPrediction在線靶點篩選平臺（http://www.Swisstargetprediction.ch/），獲取化合物的預測靶點信息。

1.3 抑菌相關靶點的檢索

以“抑菌”（antibiosis）為關鍵詞，通過Ctd（http://ctdbase.org/）、DrugBank（https://www.drugbank.ca/）及Genecards（https://www.genecards.org/）等數據庫搜索與抑菌相關的作用靶點，去除重復靶點后得到抑菌相關靶點。

1.4 蛋白互作網絡（PPI）的構建

將“1.1”所得咖啡酰奎寧酸類化合物對應靶點與“1.2”所得抑菌相關靶點進行交集，得到交集靶點，獲取咖啡酰奎寧酸類化合物抑菌的作用靶點。將交集靶點導入STRING數據庫（https://string-db.org/）獲得相互作用關系，構建PPI網絡[23]，節點表示靶點蛋白，邊表示各節點間的相互作用關系。將得到的PPI網絡信息保存為TSV文件，并將該文件數據導入網絡拓撲屬性分析軟件（Cytoscape）[24]，計算節點的度值，基于度值反映節點在網絡中的重要程度，由此識別關鍵的靶點[25]。其中Degree值排名前30 位靶點的信息如表1 所示。

表1 Degree值排名前30 位靶點信息表Table 1 Information table of the top 30 targets with Degree value

1.5 基因本體（GO）功能分析及京都基因與基因組百科全書（KEGG）分析

利用WebGestalt數據庫（http://www.webgestalt.org/）將交集靶點基于生物學過程（biological processes，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細胞組成（cell component，CC）術語進行GO功能分析[26]。利用Cytoscape軟件中的ClueGo插件對交集靶點進行KEGG通路富集分析，選取富集基因數排名前20 的通路，通 過omicshare數據庫（http://www.omicshare.com/tools/）繪制氣泡圖。

1.6 分子對接

采用AutoDock Vina軟件對咖啡酰奎寧酸類化合物抑菌前2 的靶點蛋白與綠原酸、異綠原酸A和1,3,5-O-三咖啡酰奎寧酸3 個關鍵成分進行分子對接驗證。通過RCSB PDB（http://www.rcsb.org/）數據庫獲取靶點蛋白晶體結構，再利用AutoDock對接軟件對蛋白晶體結構去水加氫、計算電荷、去除原配體，對配體分子通過Torsion Tree進行調整，運用AutoDock Vina軟件計算其對接活性位點、結合能及均方根偏差（RMSD），最后運用Pymol軟件將對接結果進行可視化分析。

2 結果與分析

2.1 咖啡酰奎寧酸類化合物對應靶點預測與抑菌相關靶點檢索

現已知咖啡酰奎寧酸類化合物共38 個，通過預測共獲得咖啡酰奎寧酸類化合物對應靶點483 個。通過Cytoscape軟件對上述活性化合物與預測靶點進行關系網絡的繪制和分析，構建“咖啡酰奎寧酸類化合物-靶點”網絡，如圖2 所示。通過檢索Ctd、DrugBank及Genecards等數據庫共獲得抑菌相關靶點805 個。

圖2 “咖啡酰奎寧酸類化合物-靶點”網絡圖Fig.2 Network diagram of "caffeoylquinic acids-target"

2.2 PPI網絡的構建

由圖3 可知，抑菌相關靶點共805 個，咖啡酰奎寧酸類化合物對應靶點共483 個，將兩者取交集后得到75 個交集靶點，這75 個交集靶點則為咖啡酰奎寧酸類化合物抑菌的作用靶點。將交集靶點借助STRING數據庫及Cytoscape軟件進行PPI網絡的構建與分析，PPI網絡如圖4 所示。此網絡包括75 個節點，479 條相互關系，其中度值排名前30 位的靶點信息如表1 所示，度值越大表明該靶點在網絡中的作用越大，由此推斷在咖啡酰奎寧酸類化合物抑菌中起關鍵作用的為TNF、AKT1、ALB、MMP9、EGFR、MAPK8、CASP3、MAPK1、MMP2 等基因靶點。TNF為咖啡酰奎寧酸類化合物抑菌最關鍵的靶點，它通過和細胞膜上的特異性受體結合，殺傷轉化細胞和某些病毒感染的細胞，參與抗病毒、抗細菌和細胞凋亡等生物過程[27]。有研究發現，感染金黃色葡萄球菌的免疫疾病患者如果暴露于TNF-α抑制劑，則可能繼續被感染[28]。AKT1能夠通過調控細胞的存活與凋亡來發揮作用[29]。ALB則可以調節血液的膠體滲透壓，進而改變細菌細胞膜的通透性，使細胞內物質泄漏，從而影響細胞代謝達到抗菌效果[30]。MMPs的水平與炎癥反應有關，MMP9則主要表達于細菌感染的炎癥反應的中性粒細胞和巨噬細胞中[31]。EGFR為人類表皮生長因子，是細胞增殖和信號傳導的受體，其通過調控細胞增殖、分裂以及血管形成等，促進癌細胞的侵襲轉移[32]。SIRT1可通過影響NF-κB細胞信號通路中乙酰化的修飾調控下游基因轉錄，調節機體代謝和預防感染[33]。IL-2 是由激活的輔助性T淋巴細胞1 產生，它能活化T細胞產生細胞因子，刺激機體產生抗體，增強單核巨噬細胞系統的功能，對病原微生物進行防御和清除，從而間接發揮抑菌作用[34]。綜上所述，上述靶點主要通過調控病毒感染細胞的增殖、分化、遷移及凋亡，調節細胞代謝、參與血管系統重塑、血管生成、組織修復及炎癥反應以及發揮對病毒感染細胞的免疫保護等功能來發揮抑菌作用。

圖4 咖啡酰奎寧酸類化合物抑菌的PPI網絡Fig.4 PPI network of the antibacterial effect of caffeoylquinic acids

2.3 GO功能分析及KEGG通路富集分析

從生物過程（BP）、細胞組分（CC）和分子功能（MF）3 個不同角度對交集靶點進行GO功能分析，結果如圖5 所示。結果表明細胞組分主要分布在細胞膜、細胞囊、細胞核、內膜系統、細胞外間隙、腔上包膜、細胞質基質、蛋白復合體、線粒體、核內體、核被膜、細胞外基質、液泡、內質網、細胞突起、高爾基體、細胞骨架、染色體和脂滴等部位。分子功能主要集中于蛋白結合、離子結合、水解酶活性、核苷酸結合、轉移酶活性、核酸結合、分子轉運活性、酶調節活性、脂質結合活性、轉運活性、糖結合、翻譯調節活性、染色質結合、抗氧化活性、電子轉移活性和氧結合。生物過程主要涉及應激反應、代謝過程、生物調節、多細胞生物過程、細胞訊息傳遞、細胞定位、細胞成分組織、發育過程、多組織過程、細胞增殖、繁殖、生長等。

圖5 咖啡酰奎寧酸類化合物抑菌作用靶點GO分析Fig.5 GO analysis of antibacterial targets of caffeoylquinic acids

對交集靶點進行KEGG通路富集分析，富集基因數排名前20 的信號通路如圖6 所示，結果表明咖啡酰奎寧酸類化合物抑菌的作用機制主要涉及細胞外基質組織（Extracellular matrix organization）、細胞外基質降解（Degradation of the extracellular matrix）、膠原蛋白降解（Collagen degradation）、基質金屬蛋白酶的激活（Activation of matrix metalloproteinases）、NGF信號通路（NGF signalling）等作用通路。

圖6 咖啡酰奎寧酸類化合物抑菌關鍵靶點KEGG通路富集分析Fig.6 KEGG pathway enrichment analysis of key antibacterial targets of caffeoylquinic acids

與通路相關的基因靶點如表2 所示，通路與其相關靶點之間的相互關系如圖7 所示。從表2 可以看出，細胞外基質降解（Degradation of the extracellular matrix）主要涉及ADAM17、CASP3、CTSK、CTSL、CTSS、ELANE、FURIN、MMP1、MMP2、MMP7、MMP8、MMP9、PLG共 14 個基因靶點，其 中ADAM17 可參與細胞粘附、融合、遷移及信號傳導，CASP3 可調控細胞凋亡，CTSK可參與細胞外基質降解，ELANE基因能夠參與多種炎癥反應，MMPs基因則可以降解細胞外基質、激活膠原蛋白酶以及膠原纖維并參與血管系統重塑、血管生成、組織修復、腫瘤浸潤及炎癥反應，PLG則參與組織重塑和腫瘤侵襲過程。基質金屬蛋白酶的激活（Activation of matrix metalloproteinases）共涉及CTSK、ELANE、FURIN、MMP1、MMP2、MMP7、MMP8、MMP9、PLG、TPSAB1 共10 個基因，這些靶點主要參與細胞外基質降解、多種炎癥反應，并在細胞外基質的蛋白水解和白細胞遷移中起重要作用。NGF信號通路（NGF signalling）涉及ADAM17、CASP3、FURIN、IKBKB、MAPK1、MAPK14、MAPK8 共7 個基因；其中，CASP3 是caspase級聯激活下游的關鍵成分，是誘導細胞凋亡的蛋白酶，執行細胞凋亡過程[36]；MAPK1 則參與細胞生長、粘附、存活和分化，MAPK14 能夠刺激促炎性細胞因子的釋放及激活轉錄因子，MAPK8 可以調控細胞增殖、分化、遷移及凋亡。綜上所述，一條作用通路可涉及多個靶點，一個靶點可參與多條通路，證實了咖啡酰奎寧酸類化合物抑菌是一個涉及多個靶點、多個通路的復雜過程。

圖7 咖啡酰奎寧酸類化合物抑菌作用靶點與作用通路網絡分析Fig.7 Caffeoylquinic acids antibacterial targets and pathway network analysis

表2 KEGG通路富集分析相關基因Table 2 Related genes for KEGG pathway enrichment analysis

2.4 分子對接驗證

為了驗證咖啡酰奎寧酸類化合物預測靶點的準確性，本研究采用AutoDock Vine軟件對3 個關鍵成分和2 個靶點進行分子對接，以自由結合能（binding energy）作為篩選條件，結合能越小表示對接結果越好。對于多構象的對接結果，篩選出結合能最低的對接構象，如表3 所示。化合物與分子靶點對接得分均大于5.0，表明分子對接結果良好，驗證了網絡構建預測的準確性。運用Pymol軟件，根據結合能的大小選出每個靶點蛋白對接最好的化合物進行可視化分析，結果如圖8 所示，其中TNF與綠原酸、異綠原酸A，AKT1 與1,3,5-O-三咖啡酰奎寧酸均可以形成氫鍵，為進一步整合探析咖啡酰奎寧酸類化合物抑菌提供理論參考。

圖8 TNF、AKT1 與關鍵成分的最佳對接構象Fig.8 Optimal docking conformation of TNF,AKT1 and key components

表3 2 個靶點與3 個關鍵成分的分子對接得分Table 3 Molecular docking scores of 2 targets and 3 key components

3 結論

采用網絡藥理學的方法，借助相關數據庫及軟件對咖啡酰奎寧酸類化合物抑菌的作用靶點、作用機制及相關通路進行了探討，結果表明咖啡酰奎寧酸類化合物抑菌作用靶點為75 個。PPI網絡分析結果得出咖啡酰奎寧酸類化合物抑菌的關鍵靶點為TNF、AKT1、ALB、MMP9、EGFR、MAPK8、CASP3、MAPK1、MMP2 等；GO功能分析結果表明咖啡酰奎寧酸類化合物抑菌主要涉及細胞膜、細胞囊、細胞核、內膜系統、細胞外間隙、腔上包膜、細胞外基質等細胞組分，涉及蛋白結合、離子結合、水解膜活性、核苷酸結合、轉移酶活性、核酸結合、分子轉運活性等分子功能以及參與應激反應、代謝過程、生物調節、多細胞生物過程、細胞訊息傳遞、細胞定位、細胞成分組織等多個生物過程；KEGG通路富集分析結果表明主要涉及細胞外基質組織信號通路、細胞外基質降解信號通路、膠原蛋白降解信號通路、基質金屬蛋白酶的激活信號通路、NGF信號通路等多條途徑，表明咖啡酰奎寧酸類化合物能夠通過多靶點、多途徑發揮抑菌作用。通過分子對接驗證得到關鍵化合物與關鍵靶點對接得分均大于5.0，TNF與綠原酸、異綠原酸A，AKT1 與1,3,5-O-三咖啡酰奎寧酸均可以形成氫鍵，表明分子對接結果良好，驗證了網絡構建預測的準確性，可以為后期的抑菌藥物研究提供理論基礎和實驗數據。雖然本研究預測所得到的咖啡酰奎寧酸類化合物抑菌作用靶點與迄今為止的研究較為接近，表明運用網絡藥理學方法探討其作用機制具有一定的參考價值，但是網絡藥理學是基于數據進行研究，尚不能確保結果完全準確，因此還需要研究其具體分子機制以得到更為科學準確的結果。