陽離子魔芋葡甘聚糖的制備與表征

張馨如，李曉丹，郭麗萍，黃國清，肖軍霞

（青島農業大學食品科學與工程學院，山東青島 266109）

魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan,KGM）又稱魔芋葡甘露聚糖、魔芋膠、魔芋粉，是一種從魔芋（Amorphophallus rivieri）塊莖中提取的中性半纖維素復合雜多糖，具有良好的持水性、增稠性、凝膠性和成膜性，同時還擁有優異的結腸靶向傳輸能力，因此在食品加工、生物醫藥和功能材料等領域具有廣泛的應用[1]。多糖-蛋白質之間的相互作用及兩者形成的復合物在食品、醫藥、化妝品、材料等領域顯示出了極大的應用前景[2?4]，是當前的一個研究熱點。然而，天然KGM不帶電荷，這限制了KGM在這一新興領域的應用。對KGM進行離子化改性使其帶上電荷后可以與多種帶相反電荷的聚電解質通過靜電相互作用相結合，這對于拓展KGM的應用范圍具有重要意義。

目前KGM的離子化改性方法主要有陽離子化改性和陰離子化改性兩種，其中陰離子化改性是最常見的方法，其技術已日趨完善，相關報道也較多。常見的陰離子改性劑有乙酸[5]、聚乙烯亞胺[6]、十六烷基三甲基氯化銨等[7]。例如，肖蕊等[8]用乙酸對KGM進行羧甲基化處理得到了不同取代度的羧甲基魔芋葡甘聚糖（carboxymethyl konjac glucomannan,CMKGM），然后選取適當取代度的CMKGM制膜并測定其機械性能，發現改性后膜的性能得到了很大改善。

相比較而言，KGM的陽離子化改性目前可見文獻相對較少。已經報道的陽離子化改性方法有酯化法[9]、醚化法[10]、添加加成試劑法[11]等，其中醚化法最為常見且主要的醚化劑包括環氧丙烷[12]、陽離子瓜爾膠[13]、三聚磷酸鈉[14]等。3-氯-2-羥丙基三甲基氯化銨（3-Chloro-2-hydroxypropyltrimethyl ammonium chloride，HAT）是一種重要的陽離子醚化劑，它容易與含有活潑氫的化合物發生化學反應而得到含有季銨基的衍生物，該反應副產物少、工藝簡單，已被廣泛用于淀粉、殼聚糖等天然多糖的陽離子化改性，在KGM改性中的應用也已有少量報導。牛春梅等[15]以HAT為醚化劑、異丙醇為分散劑對魔芋精粉進行陽離子化改性以制備陽離子KGM（cationic KGM,CKGM），研究了HAT用量、催化劑NaOH用量、反應溫度和反應時間對取代度的影響,發現反應程度過高或過低都不利于CKGM取代度的提高，這為HAT在KGM改性中的應用提供了重要參考。聚電解質在靜電相互作用領域的應用與其zeta電勢密切相關，但是目前尚未見到KGM的HAT醚化改性條件與其衍生物zeta電勢之間關系的報導，這在一定程度上限制了CKGM在聚電解質復合物、多層乳液、微囊化等領域的應用。

針對上述問題，本文擬以HAT為醚化劑對KGM進行陽離子改性以改善其理化性質，研究反應溫度、反應時間及催化劑NaOH和醚化劑HAT用量對CKGM zeta電勢的影響，并研究CKGM的zeta電勢與其溶解度、乳化能力、微觀結構和粘彈性等性質之間的關系，并對其與大豆分離蛋白（soybean protein isolate SPI）發生靜電相互作用的能力進行初步研究，以期為拓展CKGM作為一種新型陽離子聚電解質在食品工業中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魔芋精粉（食品級）湖北強森魔芋科技有限公司；大豆色拉油（食品級）潤泰集團有限公司；SPI（食品級）山東高唐藍山團；HAT（分析純）上海麥克林生化科技公司；異丙醇、NaOH、無水乙醇分析純，萊陽市康德化工有限公司。

BS214D分析天平 賽多利斯科學儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限公司；FE20 pH計 梅特勒-托利多儀器有限公司；DC-26MT低溫恒溫槽 寧波天恒儀器廠；FJ200-SH數顯高速分散均質機 上海標本模型廠制造；DL-5-B低速大容量離心機 上海安亨科學儀器廠；HH-S2 數顯恒溫水浴鍋 金壇市醫療儀器廠；SHZ-Ⅲ循環水真空泵 上海亞榮生化儀器廠；MCR102 動態剪切流變儀 奧地利安東帕有限公司；ZEN3690 馬爾文動態光散射儀 英國馬爾文公司；JSM-840A掃描電子顯微鏡 日本電子株式會社；NicoleIR200 傅里葉變換紅外光譜儀 賽默飛世爾科學儀器公司；200V-1000V電子調溫萬用電爐中國龍口市先科儀器公司；DGX-9243 電熱鼓風干燥箱 上海?，攲嶒炘O備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 CKGM的制備 將5 gKGM緩慢加入到裝有30 mL異丙醇的燒杯中，在磁力攪拌器攪拌下滴加NaOH，在一定溫度下反應一段時間后加入HAT，繼續攪拌使到達反應設定時間后，用1 mol/L HCl調節溶液pH至6.0。向反應體系中加入無水乙醇使乙醇濃度達到80%（v/v），靜置30 min后收集沉淀，用80%（v/v）的乙醇水溶液沖洗數次，于50 ℃烘箱內烘干至恒重，研磨成粉即得CKGM，置于干燥器中備用[16]。

1.2.2 反應條件對CKGM zeta電勢的影響

1.2.2.1 反應時間的影響 按照1.2.1 的方法，使NaOH和KGM的質量比為1:1、HAT和KGM的質量比為1:2，在40 ℃下分別反應1、1.5、2、2.5、3 h后制得CKGM，使用馬爾文動態光散射儀測定其zeta電勢。

1.2.2.2 反應溫度的影響 按照1.2.1 的方法，使NaOH和KGM的質量比為1:1、HAT和KGM的質量比為1:2，調節反應溫度分別為40、45、50、55、60 ℃，反應1 h后制得CKGM，使用馬爾文動態光散射儀測定其zeta電勢。

1.2.2.3 催化劑NaOH用量的影響 按照1.2.1 的制備方法，使HAT和KGM的質量比為1:2、NaOH和KGM的質量比分別為1:1、1.5:1、2:1、2.5:1 和3:1，在40 ℃下反應1 h后制得CKGM，使用馬爾文動態光散射儀測定其zeta電勢。

1.2.2.4 醚化劑HAT用量的影響 按照1.2.1 的制備方法，使HAT和KGM的質量比分別為1:1、1.5:1、2:1、2.5:1 和3:1，NaOH和KGM的質量比為1:1，在40 ℃下反應1 h后制得CKGM，使用馬爾文動態光散射儀測定其zeta電勢。

1.2.3 CKGM zeta電勢的測定 將CKGM粉末溶解于去離子水中使其濃度達到0.1%（w/v），取1 mL溶液注入ZEN3690 馬爾文動態光散射儀的樣品池中，于室溫下測定zeta電勢。

1.2.4 CKGM溶解性的測定 取約0.1 gCKGM粉末（記為W）于燒杯中，倒入24.9 g的去離子水冰塊，于0 ℃冰浴中保持1 h直至冰塊完全融化。將該溶液于4000 r/min下離心20 min，取上清液于105 ℃干燥箱中干燥至恒重，記為m，按下式計算CKGM的溶解度：

1.2.5 CKGM乳化能力及乳液穩定性的測定 取0.1 gCKGM于燒杯中，倒入24.9 g的去離子水冰塊，于0 ℃下維持約1 h直至冰塊完全融化。向該溶液中緩慢加入8.3 mL大豆色拉油，用FJ200-SH數顯高速分散均質機于10000 r/min下分散5 min。將乳狀液轉移至10 mL刻度離心管中，3000 r/min離心15 min，記錄乳化層高度和液體總高度，按下式計算CKGM的乳化能力（emulsification activity index,EAI）。

將所得乳液靜置24 h后3000 r/min離心15 min，記錄離心管中乳化層的高度和液體總高度，按下列公式計算乳液穩定性（emulsion stability index,ESI）[17]。

1.2.6 FTIR分析 將CKGM粉末與干燥的KBr按1:100 質量比混合，壓片后于NicoleIR200 傅里葉變換紅外光譜儀上在波數400～4000 cm?1范圍內以分辨率4 cm?1進行掃描分析，每個樣品掃描32 次[14]。

1.2.7 微觀結構分析 在樣品臺上貼上一層雙面膠，取適量CKGM放置于樣品臺上，然后噴金供SEM觀察，電壓為2 kV[18]。

1.2.8 流變學特性研究 將質量分數為0.01%（w/v）的CKGM水溶液置于校正好的MCR102 動態流變儀平臺上，在（30±0.2）℃下，用錐板（1 o）在板間距離為0.1 mm的條件下進行頻率掃描。頻率掃描的范圍為0～50 Hz，記錄溶液儲能模量（G′）和損耗模量（G′′）隨掃描頻率的變化。

1.2.9 CKGM與SPI的相互作用 將濃度均為1%（w/v）的CKGM溶液與SPI溶液等體積混合，調節pH至6.0，靜置24 h，觀察反應體系的外觀并拍照。

1.3 統計分析

每個實驗重復3 次，結果以平均值±標準差表示。采用SPSS統計軟件（SPSS Statistics 17.0.1）進行t檢驗和方差分析，當P<0.05 時認為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 反應條件對CKGM zeta電勢的影響

2.1.1 反應時間和反應溫度對CKGM zeta電勢的影響 反應時間、反應溫度對CKGM zeta電勢的影響見圖1?？梢钥闯?，在本文所選擇條件下得到的CKGM均帶正電荷，表明成功發生了改性反應。當反應時間低于1.5 h時，CKGM的zeta電勢隨著反應時間的延長逐漸變大，當反應時間為1.5 h時達到最大值30.3 mV；此后，隨著反應時間的進一步延長，CKGM的zeta電勢開始下降，當反應時間為3.0 h時達到最小值6.68 mV（圖1a）。反應溫度對CKGM zeta電勢的影響也呈現出類似的趨勢，反應溫度為55 ℃時CKGM的zeta電勢達到最大值32.3 mV；隨著反應溫度的進一步升高，CKGM的zeta電勢隨之降低，當反應溫度為60 ℃時zeta電勢接近于0（圖1b）。這一趨勢與這兩個因素對CKGM取代度的影響一致，可能是由于反應時間過長或反應溫度過高時會導致多種副反應的發生[15]，從而使得CKGM電荷隨著反應程度的增加而增加的趨勢不一致。因此在利用HAT制備CKGM時需嚴格控制反應的程度以獲得所需的zeta電勢，反應程度過高或過低均不利于CKGM zeta電勢的提高。

圖1 反應時間（a）和反應溫度（b）對CKGM zeta電勢的影響Fig.1 Effect of reaction time and temperature on the zetapotential of CKGM

2.1.2 醚化劑HAT和催化劑NaOH用量對CKGM zeta電勢的影響 催化劑NaOH和醚化劑HAT用量對CKGM zeta電勢的影響見圖2。隨著NaOH（圖2a）和HAT（圖2b）用量的逐漸增加，CKGM的zeta電勢均呈現先增加后減小的趨勢，當HAT和KGM的質量比為2:1、NaOH和KGM的質量比為2:1 時，CKGM zeta電勢分別達到最大值，均為36.0 mV。這可能是當體系中有少量HAT和NaOH存在時，CKGM的結合位點并未達到飽和，此時CKGM的 zeta電勢隨著兩者用量的增加而增大；當zeta電勢達到最大值后，CKGM的結合位點達到飽和，此時再繼續增加HAT會導致反應體系中水含量的增加[15]，不利于反應的進行，且NaOH過量不但會加速CKGM的分解，還會大量聚集在CKGM表面并中和CKGM所帶的正電荷，從而導致zeta電勢變小。張朝輝等[19]使用HAT醚化十二烯基琥珀酸酯化淀粉漿料時也發現，酸化淀粉的zeta電勢隨著醚化劑HAT的加入呈現先增加后減小的趨勢。

圖2 催化劑NaOH（a）和醚化劑HAT（b）和用量對CKGM zeta電勢的影響Fig.2 Effects of NaOH (a) and HAT(b) amount on the zetapotential of CKGM

上述研究表明，反應時間、反應溫度及醚化劑和催化劑用量均可對CKGM所帶電荷量產生重要影響。為了研究CKGM的zeta電勢與其性質之間的關系，本文在反應溫度為55 ℃、NaOH和KGM的質量比為2:1、HAT和KGM的質量比分別為1:1、1.5:1 和2:1 條件下反應1.5 h制得了zeta電勢分別為4.79、23.3 和36.0 mV的CKGM對其進行后續研究，以未改性的KGM為參照。

2.2 溶解性

CKGM的zeta電勢對其溶解度的影響見圖3?？梢钥闯?，HAT醚化改性可以顯著提高KGM的溶解性，且隨著zeta電勢的增加，CKGM的溶解性越大，這與CMKGM溶解性與其電荷密度之間的關系一致[20]。未改性的KGM樣品的溶解度為55%，而改性后的CKGM溶解度均在65%以上，且當zeta電勢為36.0 mV時達到最大值78%。造成這種現象的原因可能是由于隨著醚化反應程度的增加，KGM分子鏈中大量羥基被陽離子所取代，導致CKGM分子之間形成氫鍵的能力減弱；同時隨著電荷密度的增加，CKGM膠體之間的排斥作用也隨之增強，這進一步阻止了它們之間的聚集，從而使得CKGM的溶解性顯著提高[1,16]。

圖3 zeta電勢對CKGM溶解性的影響Fig.3 Effects of zetapotential on the water solubility of CKGM

2.3 乳化能力及乳液穩定性

CKGM的zeta電勢對其乳化性能的影響見圖4。可以看出，天然KGM并沒有乳化能力，但經過HAT醚化改性后開始具備一定的乳化能力，且隨著zeta電勢的增加，CKGM的乳化能力和乳液穩定性均呈現先增加后降低的趨勢，且均在zeta電勢為23.3 mV時達到最大值分別為22.7%和21.3%（圖4a～b）。這是由于HAT是一種季銨型陽離子表面活性劑，其與KGM發生醚化反應也會賦予后者一定的乳化能力，且隨著醚化反應程度的增加CKGM的乳化能力隨之增加；但是當醚化反應程度過高、即CKGM的zeta電勢過大時，CKGM的親水性過強、溶解性過大，導致其乳化能力和乳液穩定性反而開始降低。

圖4 zeta電勢對CKGM乳化性能（a）和乳液穩定性（b）的影響Fig.4 Effect of zetapotential of on the emulsification ability (a)and emulsion stability (b) of CKGM

2.4 FTIR分析

不同zeta電勢CKGM的紅外光譜見圖5。對于KGM，3361 和3393 cm?1為-OH的伸縮振動，1160 和1083 cm?1歸屬于-CH2-O-CH2的伸縮振動[21]。經過陽離子醚化改性后在3030、3027 和3029 cm?1處出現了新的振動峰，可以歸屬于-CN伸縮振動，且隨著CKGM的zeta電勢的增加，這一伸縮振動頻率逐漸增強，而這類伸縮振動在KGM中并不存在，這說明KGM與HAT發生了醚化反應。

圖5 KGM（a）和zeta電勢為4.79 mV（b）、23.3 mV（c）和36 mV（d）時 CKGM的紅外光譜圖Fig.5 FTIR spectra of KGM (a)and CMKGM with zeta potential 4.79 mV (b),23.3 mV (c) and 36 mV (d)

2.5 微觀結構分析

不同zeta電勢CKGM的微觀結構見圖6。可以看出，天然KGM顆粒表面光滑有凹陷（圖6a）；經過醚化處理后得到的CKGM顆粒仍呈球狀、表面有皺縮，且其粒徑隨著zeta電勢的增加而降低（圖6b～d），這進一步證實KGM成功發生了化學反應，HAT醚化改性破壞了KGM原有的微觀結構，且醚化反應程度越大、zeta電勢越高，CKGM的結構變化越明顯、粒徑越小[22]。

圖6 KGM（a）和zeta電勢為4.79 mV（b）、23.3 mV（c）和36 mV（d）時CKGM的掃描電鏡圖(500×)Fig.6 SEM graphs of KGM (a) and CKGM with zeta potential 4.79 mV (a),23.3 mV (b) and 36 mV (c) (500×)

2.6 流變學特性分析

CKGM的zeta電勢對其流變學特性的影響見圖7。KGM的儲能模量G′大于損耗模量G″（圖7a），說明KGM溶液形成了凝膠并表現出了固體的性質[23]，而不同電勢CKGM的損耗模量G″均大于儲能模量G′，且G′均接近于0（圖7b～d），表現出明顯的液體狀態。這表明，發生醚化反應后KGM的凝膠性能顯著降低，這與陳國峰等[24]對KGM醚化改性產物的流變學特性的研究結果相似，同時也與本文圖3 中推測的CKGM分子間氫鍵被削弱的推測相對應。另外，CKGM的zeta電勢對其損耗模量（G′）有重要影響。當zeta電勢為4.79 mV時（圖6b），CKGM溶液的損耗模量最大，表明此時溶液的粘度仍然較大，CKGM分子之間的氫鍵相互作用仍然較為強烈；當zeta電勢為23.3 mV時（圖6c），由于醚化反應程度較高、分子內和分子間氫鍵破壞嚴重，CKGM溶液的損失模量隨之顯著降低；但是當CKGM的zeta電勢進一步增加至36.0 mV（圖6d）時，雖然KGM分子間原先的氫鍵破壞嚴重，但是大量氨基的引入又增強了分子間的氫鍵相互作用，因此其溶液的損耗模量與23.3 mV時相比又有所增加。

圖7 KGM（a）和zeta電勢為4.79 mV（b）、23.3m V（c）和36 mV（d）時CKGM的頻率掃描曲線Fig.7 Frequency scanning curve of KGM (a) and CKGM with zeta potential 4.79 mV (b),23.3 mV (c) and 36 mV (d)

2.7 CKGM與SPI的相互作用

當兩種帶相反電荷的聚電解質在溶液中共存時，兩者會通過靜電相互作用形成復合物并發生聚集而形成沉淀[25]，因此通過觀察是否有沉淀產生以及沉淀量的多少便可初步判斷兩者是否發生了相互作用。為了驗證CKGM是否可以與帶相反電荷的聚電解質發生靜電吸引，本文對其與SPI在pH6.0 下的相互進行了初步研究，結果如圖8 所示。

圖8 CKGM溶液與SPI溶液混合后（a）及靜置24 h（b）后的外觀Fig.8 Appearances of the mixture of the CKGM and SPI solutions before (a) and after standing for 24 h (b)

由圖8a和8b可知，KGM與帶負電荷的SPI溶液混合后沒有產生沉淀，混合溶液較為均一，且放置24 h后無明顯變化，表明兩者未發生相互作用；而CKGM與SPI混合后溶液變得渾濁，且放置24 h后有明顯的沉淀析出，表明CKGM與SPI之間發生了靜電相互作用并形成了不溶性復合物。CKGM的zeta電勢對其與SPI的相互作用有重要影響。由圖8a和8b可以看出，醚化反應程度對CKGM與SPI的相互作用及所得復合物的沉淀性能有重要影響。當zeta電勢為4.79 mV時，CKGM可與SPI形成可溶性復合物，但是放置24 h后會充分沉淀；當zeta電勢為36.0 mV時，CKGM與SPI的相互作用明顯增強，溶液的濁度明顯增加，且放置24 h會出現沉淀，但是上清液仍較為混濁。這可能是由于當醚化反應程度較低時，CKGM分子間的氫鍵相互作用較強，以聚集體形式存在，因此與SPI發生靜電吸引后形成的復合物分子較大，因此放置之后充分沉淀；而當醚化反應程度較高時，CKGM分子間的氫鍵相互作用破壞嚴重，雖然其與SPI的相互作用程度有所增加，但是所形成的復合物粒徑較小，因此放置后雖然仍然能夠發生沉淀，但是其沉淀的程度不如低醚化反應程度。需要說明的是當zeta電勢為23.3 mV時，CKGM與SPI的反應程度遠低于另外兩個zeta電勢，這可能是其分子間氫鍵被破壞與靜電相互作用相比占主導的結果。

3 結論

當反應溫度為55 ℃、反應時間為1.5 h、NaOH與KGM質量比為2:1、HAT與KGM質量比為2:1 時，所得CKGM的zeta電勢達到最大值36 mV，醚化反應程度過高或過低均不利于zeta電勢的提高。醚化改性可以顯著提高CKGM的溶解性和乳化性能，且與CKGM的zeta電勢密切相關。醚化反應會改變KGM的外觀形態，并使其粒徑變小。CKGM可與SPI通過靜電相互作用形成復合物，且zeta電勢對反應程度有重要影響。因而，使用HAT可以成功對KGM進行陽離子醚化改性且改性后KGM的功能性質有了明顯改善，有望在食品領域獲得新的應用。