真空微波干燥中微波強度對胡蘿卜和南瓜中類胡蘿卜素生物利用率的影響

聶梅梅，肖亞冬，張鐘元，李大婧，宋江峰，劉春泉，劉春菊，王曉燕，江 寧，馮 蕾

（江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇南京 210014）

類胡蘿卜素是一種天然色素，研究表明其具有降低心血管疾病、抗氧化與保護視力等多種功能[1?2]。新鮮水果和蔬菜富含多種類胡蘿卜素，是人們日常膳食中類胡蘿卜素的主要來源，但研究發現新鮮水果蔬菜中類胡蘿卜素在人體中的生物利用度不足5%[3?4]。植物中的類胡蘿卜素主要以結合蛋白的形式存在于葉綠體或色素母細胞等有色體結構中[5]，進一步經過細胞壁釋放至消化系統中，被人體吸收利用。大量研究表明熱加工過程對植物組織和細胞結構的破壞作用可能改變基質的滲透性，進而影響類胡蘿卜素生物利用[6]。Bengtsson等[7]研究表明蒸煮前均質處理，有利于甘薯細胞壁破裂和有色體的聚集，從而顯著提高β-胡蘿卜素生物利用度。Zhang等[8]研究表明熱風干燥增加胡蘿卜和黃椒中類胡蘿卜素釋放量，原因是熱風干燥導致細胞壁破裂；而西蘭花中由于細胞體積小、細胞壁緊密結合，熱加工中所受破壞小，因此其類胡蘿卜素釋放量較低。Palmero等[9]研究表明熱處理導致番茄的細胞壁解聚產生的細胞壁組分形成了屏障，從而降低其番茄紅素的生物利用度。由此可見，加工過程中食物類胡蘿卜素基質環境的變化，是影響類胡蘿卜素的生物利用率重要因素。

真空微波干燥能較好地保留被干燥物料原有的色香味、維生素等熱敏性營養成分或生物活性成分，顯著提高和改善干燥產品品質，已在食品加工行業廣泛應用[10?11]。研究發現，當壓強、微波功率適當時，會使細胞壁破裂，營養素大量釋放[11?12]。汪小娉等[13]研究發現增大真空度有利于提高類胡蘿卜素保留率。此外，真空微波干燥可改變細胞壁多糖的親水性，使細胞壁皺縮變形[14]，微波處理對果蔬細胞壁微觀結構的影響正是類胡蘿卜素生物釋放所需條件，但與類胡蘿卜素生物利用率的關系尚不明確。為了明確微波干燥過程中，不同微波強度條件下蔬菜中類胡蘿卜素生物利用率的變化規律，本實驗以富含類胡蘿卜素的胡蘿卜和南瓜為原料，基于細胞壁結構的變化，采用體外模擬消化法，探究不同微波強度對南瓜和胡蘿卜類胡蘿卜素保留率、生物利用率的影響，探討食物加工方式對類胡蘿卜素基質環境的作用進而對其生物利用的影響，以期為類胡蘿卜素高效生物利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胡蘿卜品種‘心黑田五寸’、南瓜品種‘蜜本南瓜’

南京市孝陵衛集貿中心；β-胡蘿卜素、葉黃素標準品 美國Sigma公司；丙酮、無水乙醇、鹽酸、硫酸、氫氧化鈉、氯仿、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、碳酸氫鈉 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；甲醇、甲基叔丁基醚（MTBE）色譜純，美國天地有限公司。

VDM-1 型真空微波干燥設備 南京孝馬機電設備廠；HZQ-F100 全溫度振蕩培養箱 太倉市華美生化儀器廠；CPA-125 電子天平 德國Sartorius公司；RE52CS旋轉蒸發儀、B-226 恒溫水浴鍋 上海亞榮生化儀器廠；D10 氮氣吹掃儀 杭州奧盛儀器有限公司；1200 高效液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司；E200MV生物顯微鏡 南京尼康江南光學儀器有限公司；日立H-7650 透射電子顯微鏡 日立高新技術公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 新鮮胡蘿卜和南瓜經清洗、去皮（南瓜需去除瓜籽及瓜瓢）后切成厚度約為(7±2) mm的薄片，置于95 度水中燙漂40 s滅酶后，取出瀝干。

采用以微波間歇比為1 的間歇加熱方式，分別稱取瀝干后的胡蘿卜和南瓜各100 g，置于真空微波干燥設備中，真空度為?90 kPa，分別設置四個不同微波強度為：6、9、12、15 W/g，將胡蘿卜和南瓜干燥至干燥終點（水分含量約為5%，以干基計算），裝入不透光自封袋，置于干燥器中備用。

1.2.2 體外消化模型 本研究中使用的靜態體外消化模型，根據文獻稍微修改[15?16]。將胡蘿卜和南瓜鮮樣及不同微波強度處理后的樣品，剪碎置于組織研磨機適配器中，置于組織研磨機中研磨45 s（60 Hz）。首先配制人工胃液成分為：CaCl2·2H2O、KH2PO4、MgCl2·6H2O、NaCl、KCl，濃度分別為10、3.5、3.6、50、14 mmol/L。準確稱取1 g樣品研磨物于50 mL試管中，加入15 mL胃液，用1 mol/L的HCl調節pH至 2.00±0.05 后加入胃蛋白酶（21 mg/mL，914 U/mg），樣品通入氮氣覆蓋封口后，置于搖床（37 ℃，120 r/min）消化1 h。再用1 mol/L的NaHCO3調節溶液pH至6.9±0.05，隨后加入3 mL的腸液（豬胰酶、豬膽鹽濃度分別為4.5 mg/mL、28 mg/mL、豬胰酶250 U/mg），樣品用氮氣覆蓋封口后置于搖床（37 ℃，120 r/min）消化2 h。整個過程在暗處進行。

1.2.3 微觀結構觀察

1.2.3.1 光學顯微鏡觀察 鮮樣、真空微波處理后樣品及經體外模擬消化后消化液的觀察方法參考文獻[17]的方法。

1.2.3.2 細胞壁過碘酸雪夫（PAS）染色 鮮樣及真空微波處理后樣品細胞壁PAS染色觀察方法參考文獻[17]的方法。

1.2.3.3 透射電鏡測定 鮮樣及真空微波處理后樣品經體外模擬消化后消化液的透射電鏡觀察方法參考文獻[17]的方法。

1.2.4 類胡蘿卜素的生物利用率的測定 經模擬消化后得到消化液，經離心（4 ℃，10000×g，20 min）后得到上層膠束。將膠束轉入250 mL分液漏斗中，加入等體積混合提取液混勻靜待分層，重復提取至下層無顏色。將提取液減壓濃縮、氮氣吹干，用1 mL正己烷復溶，經0.45 μm濾膜過濾后置于?80 ℃冰箱，待液相分析。樣品中類胡蘿卜素經消化后的生物利用率按下式計算。

生物利用率（%）=C上層膠束×m消化液/m總×100

式中：C上層膠束為離心后上層膠束中提取的類胡蘿卜素含量（μg/g）；m消化液為總消化液的質量（g）；m總為消化樣品所測得的類胡蘿卜素總質量（μg）。

1.2.5 類胡蘿卜素保留率的測定 類胡蘿卜素保留率測定參考文獻[13]方法。

1.2.6 類胡蘿卜素的提取與測定

1.2.6.1 類胡蘿卜素的提取 準確稱取適量的原料鮮樣（對照組，CK）及真空微波干燥后樣品，剪碎后置于磨口錐形瓶中，加入40 mL混合提取液（V（乙醇）:V（正己烷）:V（丙酮）=1:2:1）混勻，置于37 ℃恒溫培養箱中靜置過夜，將提取液轉移到圓底燒瓶中，待提取液分層，收集上層提取液，經減壓濃縮、氮氣吹干后，用1 mL正己烷復溶，重復兩次，經0.45 μm有機濾膜過濾后置于?80 ℃冰箱備用，待分析。

1.2.6.2 類胡蘿卜素的HPLC條件 采用1200 高效液相色譜儀（DAD檢測器）配備YMC-C30 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）檢測樣品中類胡蘿卜素的含量；設置進樣量為20 μL、柱溫為25 ℃、流速為0.6 mL/min；流動相A為V（甲醇）:V（MTBE）:V（水）=70:25:5、流動相B為V（MTBE）:V（甲醇）:V（水）=85:10:5。

1.2.7 消化液黏度的測定 消化液黏度的測定方法參考文獻[17?18]方法，在室溫的條件下采用MCR 302 奧地利安東帕高級旋轉流變儀測定消化液的黏度。

1.3 數據統計與分析

以上所有試驗重復三次，各試驗結果均以“平均值（means）±標準差（SD）”表示。本試驗采用Origin9.0 軟件繪制曲線，采用SAS軟件進行單因素方差分析及組間差異的Duncan’s多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 真空微波干燥對胡蘿卜和南瓜細胞形態的影響

胡蘿卜和南瓜鮮樣的光鏡圖和PAS染色圖如圖1 所示，可以看出胡蘿卜和南瓜的細胞形態差異顯著。胡蘿卜細胞大小、形狀不一，排列緊密，有色體結構為紅色梭狀的結晶狀態，分布范圍廣；南瓜細胞呈橢圓形，體積較大，有色體結構為球狀，分布于細胞壁內側。PAS染色后的多糖類物質被染成紫紅色，呈陽性。光學顯微鏡下可見胡蘿卜和南瓜鮮樣細胞完整，排列緊密。與胡蘿卜相比，南瓜細胞壁多糖層較薄。Zdunek等[19]研究表明，較大植物細胞破壞所需的機械力較小。本研究南瓜細胞較大，因此在加工過程中更易被破壞。

圖1 胡蘿卜和南瓜鮮樣的細胞形態（光學顯微鏡，40×）Fig.1 Cell morphology of carrot and pumpkin(Optical microscope,40×)

細胞壁是影響細胞內生物活性物質釋放到胞外最重要的物理屏障[20]，因此本試驗對真空微波干燥處理后胡蘿卜和南瓜進行染色處理，觀察其細胞壁變化。對比鮮樣（圖1）可知，經真空微波中強度（9 W/g）干燥后的胡蘿卜細胞皺縮嚴重（圖2），出現細胞壁斷裂現象，細胞排列更緊密。通過觀察PAS染色圖可知，胡蘿卜細胞壁染色變淺，結構疏松，細胞壁斷裂嚴重，視野中有大塊空缺存在。真空微波干燥南瓜細胞形態變化與胡蘿卜類似，但細胞皺縮更顯著。此外，真空微波干燥后的胡蘿卜和南瓜有色體結構破壞嚴重。圖2A1 中可見少量有色體結構，分布于細胞壁內側；圖2B1 中未觀察到完整的有色體結構。

圖2 真空微波干燥后胡蘿卜和南瓜的細胞形態（光學顯微鏡，40×）Fig.2 Cell morphology of carrot and pumpkin after vacuum microwave drying(Optical microscope,40×)

2.2 微波強度對胡蘿卜和南瓜消化微觀結構的影響

2.2.1 消化液光學顯微鏡圖 不同微波強度處理條件下的胡蘿卜與南瓜消化液的光鏡圖如圖3 所示。觀察胡蘿卜鮮樣消化液光鏡圖3A1 可以發現，鮮樣的消化液光鏡圖中仍可以看到完整的細胞結構，胡蘿卜細胞內部晶狀有色體結構破裂，類胡蘿卜素位于細胞壁內側，從細胞內釋放到消化液中的含量較少，大部分仍存留于細胞中。由圖3A2、A3 可知，真空微波干燥后的胡蘿卜經體外消化后，細胞壁破裂嚴重，很難找到完整的細胞結構，類胡蘿卜素從細胞內部釋放到消化液中的含量明顯高于鮮樣。觀察南瓜鮮樣消化液光鏡圖3B1 可以發現，南瓜細胞內球狀有色體結構破壞嚴重，類胡蘿卜素在細胞內部呈不規則分布，散落在南瓜細胞中，與胡蘿卜類似，大部分類胡蘿卜素仍保留于細胞中。由圖3B2、B3 可知，干燥后的南瓜變化與胡蘿卜類似，細胞壁破壞嚴重，釋放到消化液中的類胡蘿卜素含量升高。與鮮樣相似，釋放到消化液中的類胡蘿卜素并不是單獨存在，而是在其周圍形成了新的結構網絡，這可能會影響類胡蘿卜素的吸收利用。

圖3 不同微波強度條件下胡蘿卜和南瓜消化液的光學顯微鏡圖（40×）Fig.3 Photomicrographs of carrot and pumpkin digests under different microwave intensity(40×)

2.2.2 消化液透射電鏡圖 通過透射電鏡（TEM）觀察胡蘿卜和南瓜細胞的細胞壁及有色體的結構特征。真空微波干燥對胡蘿卜和南瓜消化液微觀結構影響如圖4 所示。觀察圖4A1 與圖4B1 可以發現胡蘿卜和南瓜鮮樣經消化后細胞壁仍較完整，但細胞內側膜結構與細胞壁間隙增大，部分類胡蘿卜素分布于新形成的聚集體內部。其中，胡蘿卜細胞壁厚度不均勻，內側膜結構基本完全脫離細胞壁，分散于細胞內部；南瓜細胞壁厚度較均勻。真空微波干燥處理后的蔬菜細胞壁結構松散，出現斷裂，膜結構完全從細胞壁內側脫落，形成新的聚集體，部分類胡蘿卜素分布于新形成的結構內部，與胡蘿卜相比，南瓜細胞壁降解現象更明顯。微波強度為9 W/g時，經體外消化后胡蘿卜和南瓜消化液的透射電鏡圖如圖4A2與B2，可以看出此時細胞壁降解嚴重，無完整細胞壁結構，視野中僅存在大面積絮狀結構區域。

圖4 不同微波強度條件下胡蘿卜和南瓜消化液的透射電鏡圖Fig.4 Transmission electron micrograph of digested liquid of carrot and pumpkin under different microwave intensity

通過消化液的透射電鏡圖發現，胡蘿卜和南瓜鮮樣經消化后細胞壁略有溶脹，內側膜結構脫落，但細胞內部結構并未完全被破壞，仍有類胡蘿卜素存在于膜結構中，這與Tydeman等[21]的文獻報道類似。與鮮樣相比，真空微波干燥后的蔬菜細胞結構在消化過程中破壞明顯，發生細胞壁結構斷裂、內側膜結構脫落及大面積絮狀結構等現象。這是因為真空微波干燥已經破壞了蔬菜細胞壁結構，這種被破壞了的細胞結構在消化液的處理下進一步瓦解。

2.3 不同微波強度下胡蘿卜和南瓜消化液黏度

消化液的黏度是影響活性物質生物利用度的重要影響因素。有研究發現細胞壁在高壓均質過程中會形成網狀結構，阻礙類胡蘿卜素從果蔬中高效釋放[22?23]，而未降解的細胞壁果膠會顯著增加消化液的黏度，降低消化酶的作用表面積，抑制類胡蘿卜素的膠束化，進而降低其生物利用率[24]。因此本實驗測定了不同微波強度處理后胡蘿卜和南瓜消化液黏度值（表1）。與鮮樣相比，真空微波干燥后的胡蘿卜和南瓜消化液黏度顯著下降（P<0.05），降幅分別為67.7%～87.5%，78.2%～83.8%。微波強度為12 W/g時，胡蘿卜和南瓜消化液黏度較高，分別為1.93×10?3、1.97×10?3Pa·s，但不同微波強度處理的南瓜消化液黏度差異不顯著（P>0.05）。

表1 不同微波強度條件下胡蘿卜和南瓜消化液的黏度（×10?3 Pa·s）Table 1 The viscosity in digestive fluid of carrot and pumpkin under different microwave intensity（×10?3 Pa·s）

真空微波干燥后胡蘿卜和南瓜的消化液黏度顯著低于鮮樣（P<0.05）。這是因為消化液黏度與未降解的細胞壁果膠含量有關，微波的熱效應與非熱效應共同促進了果膠的降解，破壞了原有的果膠鏈，改變了果膠的結構，使果膠的分子量降低，果膠分子間作用力減小[25]，從而導致消化液黏度下降，這與真空微波干燥強度為9 W/g時，南瓜中果膠含量降低結果一致[26]。此外，體外消化后獲得的南瓜鮮樣消化液黏度顯著高于胡蘿卜（P<0.05），這是因為南瓜細胞壁中的可溶性果膠含量高于胡蘿卜，而可溶性果膠聚合物在某種程度上可以增加消化液的黏度[18,27]。

2.4 不同微波強度對胡蘿卜和南瓜中類胡蘿卜素保留率、生物利用率的影響

真空微波干燥對胡蘿卜和南瓜中類胡蘿卜素保留率影響結果如表2 所示，結果表明隨微波強度的升高，胡蘿卜和南瓜中類胡蘿卜素保留率呈現降低的趨勢，這與汪小娉等[13]的研究結果類似。不同微波強度對類胡蘿卜素保留率有明顯影響，微波強度不同微波強度對類胡蘿卜素保留率有明顯影響，微波強度9 W/g條件下，胡蘿卜中葉黃素的保留率比6 W/g顯著降低21.51%（P<0.05），α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素的保留率分別降低8.31%、11.66%。微波強度12 與15 W/g差異不顯著（P>0.05）。真空微波干燥后的胡蘿卜和南瓜中的類胡蘿卜素的生物利用率高于鮮樣，這與圖3 消化液中類胡蘿卜素的分布結果一致，表明微波干燥處理有效提高類胡蘿卜素的生物釋放。胡蘿卜和南瓜中類胡蘿卜素生物利用率隨微波強度的增加呈現先升高后降低的趨勢，不同微波強度對類胡蘿卜素生物利用率有明顯影響。其中當微波強度為9 W/g時，胡蘿卜和南瓜中葉黃素、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素的生物利用率達到較高水平，其β-胡蘿卜素生物利用率相比于鮮樣分別增加了12.02、24.2 倍（P<0.05）。

表2 不同微波強度條件下胡蘿卜和南瓜中類胡蘿卜素的保留率、生物利用率Table 2 Retention and bioavailability of carotenoids in carrot and pumpkin under different microwave intensities

微波處理可有效地提高果蔬中類胡蘿卜素從細胞中釋放的比例，生物利用率因果蔬種類、微波條件存在顯著差異。本研究表明微波強度為9 W/g時，細胞壁變形后形成的孔隙結構增多，使蔬菜細胞結構在消化過程中破壞明顯，細胞壁嚴重破裂，導致類胡蘿卜素從有色體結構中大量釋放到消化液中，同時，真空微波干燥后消化液黏度顯著降低，這會增大消化酶的作用表面積[28]，有利于形成膠束進而提高營養素的生物利用率。這與Zhang等[29]研究結果類似，微波場能夠穿透果蔬細胞壁對類胡蘿卜素基質環境進行重排，顯著提高類胡蘿卜素的生物利用率。此外，研究表明真空微波干燥處理通過降解蔬菜細胞壁果膠，導致降低了細胞壁的阻礙作用，增加了類胡蘿卜素的生物釋放[30?31]。然而隨著微波強度升高，微波處理使物料內部分子運動加劇，水分汽化速度隨之增加[32]，干燥產生的過高溫度可能使物料內部形成一個新的物理屏障而阻礙類胡蘿卜素的釋放[33]。本研究結果表明真空微波干燥雖然降低了物料中類胡蘿卜素的保留率，但改善了其生物利用率。由此可見，真空微波干燥通過調控類胡蘿卜素基質環境提高其生物利用度，這對于果蔬中生物活性物質高效利用具有現實意義。

3 結論

本文探究不同微波強度下胡蘿卜和南瓜中類胡蘿卜素保留率、生物利用率變化規律。結果發現，真空微波干燥后的胡蘿卜和南瓜細胞壁斷裂，有色體結構嚴重破壞，導致其類胡蘿卜素的保留率降低。

經體外模擬消化，真空微波干燥后胡蘿卜和南瓜細胞結構明顯破壞，細胞壁破裂嚴重，消化液黏度顯著降低（P<0.05），進而有利于膠束化的形成，從而改善類胡蘿卜素生物利用率。當微波強度為9 W/g時，胡蘿卜和南瓜中類胡蘿卜素的生物利用率達到較高水平。