蔓性千斤拔黃酮類成分對乙酰膽堿酯酶抑制作用

王 巖，袁鳳娟，張 萌，于 璐，劉文宇，吳紅艷，高建偉，王拓一

（齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江齊齊哈爾 161006）

隨著全球人口急劇老齡化，老年人面臨著認知和記憶功能不斷惡化，日常生活行為減退并伴有各種神經癥狀和行為障礙等困境[1]。造成這種現象的一個重要原因是大腦內的乙酰膽堿受到乙酰膽堿酯酶的分解[2]。乙酰膽堿酯酶是生物神經傳導中的一種關鍵性的酶，催化乙酰膽堿水解為膽堿和乙酸，可引起大腦中乙酰膽堿水平降低，影響神經信號在生物體內的正常傳導，造成記憶喪失，神經系統退化等嚴重后果,導致增加神經突觸受體活化的時間，乙酰膽堿缺失，神經信號傳導失敗[3?4]。因此，抑制乙酰膽堿酯酶活性，提高乙酰膽堿濃度水平成為有效控制及改善阿爾茲海默癥的主要對策之一[5]。為抑制乙酰膽堿酯酶的活性，依據酶結構特點，許多乙酰膽堿酯酶抑制劑被合成出來，其中包括吖啶類化合物他克林[6]，哌啶類化合物多奈哌齊[7]，氨基甲酸酯類化合物毒扁豆堿及其衍生物[8]等，這些有機合成的抑制劑存在著半衰期短，對外圍膽堿能系統具有副作用等問題[9]。近年來，研究的熱點領域是從天然產物中獲取乙酰膽堿酯酶抑制劑，主要的活性物質包括姜黃素衍生物、黃酮類化合物和生物堿類等[10]。從天然植物中尋找抑制乙酰膽堿酯酶的活性成分具有選擇范圍廣、半衰期長和副作用小等優點，成為目前先導化合物篩選的最主要方式。

豆科（Leguminosae）千斤拔屬（FlemingiaRoxb.ex W.T.Ait.）植物，主要分布于熱帶亞洲、非洲和大洋洲等地。在我國主要生長于西南、中南和東南部各省，主要為蔓性千斤拔（Flemigia philippinensis）和大葉千斤拔（Flemingia macrophylla）兩個品種[11?13]。作為食材，千斤拔可與雞腳，豬尾等材料混合，用于煲湯，有舒緩疲勞，健腦益智等作用[14?15]。研究表明，千斤拔的提取物表現出消炎鎮痛[16]、免疫增強[17]、促進周圍和感覺神經損傷修復[18]、類神經營養因子及對腦組織、血腦屏障保護[19]等作用。千斤拔化學組成研究結果表明黃酮化合物是千斤拔屬植物最為主要的化學組成物質[20?21]，其在生物體內或體外表現出抗炎癥[22]、抗氧化[23]、抗腫瘤[24]和抗微生物[25]等生物活性作用。黃酮類化合物的上述活性構成了乙酰膽堿酯酶抑制活性的基礎，有研究表明甘草苷、姜黃素、大豆異黃酮等黃酮類化合物都表現出較好的抑制效果，如姜黃素對乙酰膽堿酯酶的半抑制濃度達到67.69 μmol/L；甘草苷能夠特異性的抑制乙酰膽堿酯酶活性，促進神經干細胞分化為膽堿能神經元等[26]，黃酮化合物分子匯總的苯環、酮羰基等內在功能團可以與乙酰膽堿酯酶的雙靶點結構，更易于抑制膽堿酯酶活性。

為進一步挖掘千斤拔植物的生物活性作用，本文以蔓性千斤拔根中黃酮化合物為目標分子。結合體外活性實驗篩選，采用柱層析等分離技術手段，從蔓性千斤拔植物中快速、高效的發現抑制乙酰膽堿酯酶的黃酮類化合物。重點針對強效抑制劑，通過體外酶學動力學實驗試驗，進行構效關系分析研究，并對抑制動力學進行探討。為發現新型乙酰膽堿酯酶抑制先導化合物及千斤拔植物的深層次利用提供理論和實驗數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蔓性千斤拔 采購于廣西省梧州市中藥材市場，廣西藥用植物園趙以民博士，鑒定為豆科千斤拔屬植物蔓性千斤拔（Flemingia philippinensis）的干燥根；電鰻乙酰膽堿酯酶（AChE）、碘化硫代乙酰膽堿、5,5′-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）美國Sigma-Aldrich公司；二甲基亞砜、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉 均來自于天津凱迪化學試劑廠；GF254 薄層色譜硅膠青島海洋化工廠；所有分離用有機溶劑 均為國產分析純。

FW177 型中草藥粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；EL104 電子分析天平 梅特勒-托利（上海）有限公司；AM500Hz核磁共振儀 德國Bruker公司；JMS-700 高分辨率（HR）質譜儀 日本JEOL公司；LC Forte/R 100 中壓色譜儀 日本YMC公司；SpectraMax M3 多模式微孔板讀數器 美國Molecular Devices公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 千斤拔預處理 取蔓性千斤拔的根，利用粉碎機粉碎，過80 目篩，在室溫條件下避光干燥，貯存備用。

1.2.2 不同有機溶劑對千斤拔活性成分提取 采用宋慶等[27]的提取方法，略作調整，具體步驟如下：取干燥粉末狀的千斤拔20 g，選用水、氯仿、乙酸乙酯、甲醇和正丁醇，以料液比為1:10 g/mL，提取溫度60 ℃，回流提取2 次，提取40 min，合并2 次濾液，真空濃縮，得到不同溶劑系統的千斤拔提取物，備用。

1.2.3 總酚含量測定 采用福林酚法，參照文獻[28]中的方法，略有改動。具體步驟如下：準確吸取沒食子酸標準儲備液0.0、0.2、0.4、0.6、1.0、1.5 mL分別置于10 mL容量瓶中，用60%乙醇溶液定容，得到沒食子酸工作液。然后分別移取沒食子酸工作液1.0 mL于10 mL比色管中，加入2.5 mL福林酚試劑，搖勻，加入2.5 mL，15% Na2CO3溶液，加水定容至刻度，搖勻。在40 ℃水浴60 min，靜置冷卻20 min。配制成濃度為0、4、8、12、20、30 mg/L的標準系列，測定其吸光度值。以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得到標準曲線y=0.0153x?0.003,R2=0.9996。千斤拔總酚含量的測定按上述方法進行，將樣品測得的吸光值代入標準曲線，計算得出的千斤拔根總酚含量用 mg GAE（gallic acid equivalent）/g表示。

1.2.4 總黃酮含量測定 采用硝酸鋁顯色法[29]，略作改動，具體過程如下：稱取20 mg蘆丁標準品，定容于100 mL容量瓶中，分別取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10 mL離心管中，加入0.3 mL，5% NaNO2搖勻，靜置6 min后加入0.3 mL 10% AlCl3靜置6 min。然后加入4.0 mL，10% NaOH，再用70 %乙醇定容至10 mL，靜置15 min，然后在510 nm處測定反應液的吸光值，以吸光值為縱坐標，標準溶液中蘆丁的質量為橫坐標，得到標準曲線 y=0.755x+0.0073,R2=0.9997，根據曲線方程計算樣品中的總黃酮含量。取1.0 mL樣品溶液按照上述操作，對吸光度進行測定，測得的吸光值代入標準曲線,總黃酮含量以蘆丁當量進行表達（RE,μg/mg）

1.2.5 乙酰膽堿酯酶活性的抑制作用測定 采用Ellmann光度法[30]檢測，通過檢測底物乙酰基硫代膽堿（Acetylthiocholine,AtCh）在乙酰膽堿酯酶（AChE）催化下水解，生成硫代膽堿（Thiocholine）,硫代膽堿與顯色劑DTNB（二硫二硝基苯甲酸）作用，產生黃色的5-硫-2-硝基苯甲酸（TNB），在412 nm測定其吸光度值，略作調整，具體操作過程如下。

在96 孔酶標板中加入150 μL磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L,pH8.04），然后加入不同稀釋濃度的樣品30 μL，再加入50 μL DTNB，然后加入20 μL稀釋后的酶液（0.54 U/mL），陰性對照孔不加酶液，以磷酸鹽緩沖液代替，在微孔振蕩器上混合均勻，置于37 ℃培養箱中保溫5 min，取出后在所有微孔中加入50 μL底物（AtCh,3 mmol/L），用酶標儀測定樣品動力學速率。條件為λ=405 nm，讀數 10 s，間隔28 s，混合3 s。

式中：A樣品表示加入樣品的吸光度；A陰性表示以磷酸鹽緩沖代替酶液反應體系的吸光度；A空白表示正常底物的反應體系的吸光度

IC50值為抑制AChE活力50%所需要的樣品提取液的濃度，mg/mL。IC50值越小，表明樣品對AChE的抑制作用越強。

1.2.6 蔓性千斤拔中乙酰膽堿酯酶抑制劑分離純化

蔓性千斤拔干燥的根600 g粉碎，采用甲醇回流提取，提取時間為40 min，料液比為1:10 g/mL，甲醇體積分數為70%，提取溫度60 ℃，提取兩次，合并濾液，真空濃縮，得到深紅色膠狀物（97 g）。

采用硅膠柱層析對提取物進行初次分離，使用正己烷和乙酸乙酯濃度梯度（50:1～1:1）洗脫，得到組分（A～E）。將組分B（2.8 g）通過中壓反向C18硅膠柱進行分離，使用甲醇和水梯度洗脫（0～100%），在20 mL/min條件下洗脫，得到11 個亞級組分（B1～B11）。其中B9～B10（126 mg）在Sephadex-LH色譜柱上使用甲醇～水（9:1）條件洗脫得到了化合物2（25 mg）。將組分D（2.6 g）通過中壓反向C18色譜柱進行分離，使用甲醇和水（0～100%），在20 mL/min的流速下梯度洗脫，得到8 個亞組分（D1～D8）。合并富含化合物1 的D3～D4 餾分（76 mg），并使用甲醇-水（4:1）在C18柱上進行洗脫分離，得到化合物1（28 mg）；組分E（1.3 g），使用C18柱進行分離，甲醇和水溶液（0～80%），在20 mL/min的流速下梯度洗脫，得到亞級餾分（E1～E5）。合并富含3 和4 的亞級組分E1 和E2（104 mg），并使用甲醇～水（85:15）通過C18柱進一步純化，得到化合物3（13 mg）和4（9 mg）,從而得到化合物1～4。

1.2.7 類黃酮結構鑒定方法

1.2.7.1 高分辨率質譜分析 質譜分析（ESI-MS）：分別取1.2.6 中分離純化的少量化合物 1～4，用色譜純甲醇進行充分溶解，通過 JMS-700 高分辨率質譜儀進行分析，采用負離子掃描模式，霧化氣和干燥氣為高純氮氣，噴霧氣壓5 Psi，干燥氣流速為4.0 L/min，干燥氣溫度為 180 ℃，毛細管電壓為3000 V，掃描范圍為質荷比 50～1000（m/z）。

1.2.7.2 核磁共振分析 分別稱取1.2.6 中分離純化后的一定量化合物1～4，使用氘帶甲醇或氯仿進行溶解，置于核磁管中，用 AM500Hz超導核磁共振波譜儀進行測定，以四甲基硅烷（TMS）作內標，化學位移δ和偶合常數 J分別采用 ppm以及 Hz表示，1HNMR以及13C-NMR的工作頻率分別為 600、150 MHz。

1.2.8 乙酰膽堿酯酶的動力學特征 通過酶標儀測得產物（TNB）吸光度值A的變化反映了AChE催化反應產物硫代膽堿濃度的變化。在不同底物濃度下,在AChE最佳催化反應區間內，即Km值基本保持恒定，每間隔10 s，測定不同底物濃度（0.009、0.0045、0.0022 mmol/L）時反應產物硫代膽堿與顯色劑DTNB生成產物的吸光度值A。用（AChE催化反應時間）～A（測得的吸光度值）作圖,得到的直線斜率反映了AChE催化反應的速率1/Vmax，接著按照Lineweaver-Burk的雙倒數作圖法,可確定抑制作用的類型。

1.3 數據處理

所有試驗重復3 次，結果表示為平均值±標準差。采用SPSS 19.0 和Origin 10.0 軟件對數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同溶劑提取物總酚含量

根據“相似相容”原理，不同溶劑對蔓性千斤拔根的總酚提取率有一定差距，結果如圖1 所示。提取物的總酚含量具有顯著區別（P<0.05)，其中甲醇提取物的總酚含量最高為（14.03 mg GAE/g DM）,氯仿提取物的總酚含量為（6.09 mg GAE/g DM）、乙酸乙酯提取物總酚含量為（6.15 mg GAE/g DM）和正丁醇提取物總酚含量為（6.75 mg GAE/g DM）次之，水提取物總酚含量為（1.4 mg GAE/g DM）最低。多酚類物質屬于中等極性物質，在極性相似的甲醇中溶解度最高。

圖1 不同溶劑提取物總酚含量Fig.1 Total phenol content of different solvent extracts

2.2 不同溶劑提取物總黃酮含量

黃酮化合物作為多酚類化合物的一大類，具有和酚類相近的極性，因此總黃酮含量的提取率趨勢與總酚含量具有相關性，結果如圖2 所示。由圖2 可得到不同有機溶劑提取物的總黃酮含量大小順序依次為：甲醇提取物總黃酮含量>氯仿提取物總黃酮含量>乙酸乙酯提取物總黃酮含量>正丁醇提取物總黃酮含量>水提取物總黃酮含量，含量趨勢和總酚含量相似，根據研究報道，千斤拔屬植物中類黃酮化合物含量最為豐富，生物活性最為多樣[13?14,17]。

圖2 不同溶劑提取物總黃酮含量Fig.2 Total flavonoids content of different solvent extracts

2.3 不同溶劑提取物對乙酰膽堿酯酶的抑制能力

提取物總酚和總黃酮含量的差距是造成不同溶劑系統提取物抑制能力差別的主要原因，實驗結果如圖3 所示。由圖3 所示，可以看出不同溶劑的提取物對乙酰膽堿酯酶的抑制能力存在一定差異，其中抑制效果由強到弱，分別為甲醇提取物半抑制率為（IC50=12 μg/mL）、正丁醇提取物半抑制率為（IC50=18 μg/mL）、氯仿提取物半抑制率為（IC50=29 μg/mL）、乙酸乙酯提取物半抑制率為（IC50=31 μg/mL）和水提取物半抑制率為（IC50=45 μg/mL）。

圖3 不同溶劑提取物乙酰膽堿酯酶活性抑制能力Fig.3 Inhibition ability of acetylcholinesterase activity of different solvent extracts

2.4 分離純化類黃酮的結構鑒定

通過分離純化得到4 種黃酮化合物如圖4 所示,它們的核磁共振氫譜、碳譜和質譜的相關信息如下。

圖4 分離純化4 中類黃酮化合物Fig.4 Separation and purification of 4 flavonoids from Flemigia philippinensis roots

2.4.1 化合物1 白色粉末，ESI-MS:m/z271[M+H]+,分子式為C15H10O5,1H-NMR（500 MHz,CDCl3）,δ:8.05（1H,s,H-2）,6.22（1H,s,H-5）,6.33（1H,s,H-8）,7.38（1H,d,J=8.5,H-2′）,7.38（1H,d,J=8.5,H-3′）,6.86（1H,d,J=8.5,H-5′）,6.86（1H,d,J=8.5,H-6′）.13C-NMR（CDCl3）δ:181.62（C-4）,165.04（C-7）,163.94（C-5）,159.03（C-9）,158.40（C-4′）,154.27（C-2）,131.16（C-2′,C-6′）,124.01（C-3）,123.04（C-1′）,115.95（C-3′,C-5′）,106.12（C-10）,99.84（C-6）,94.47（C-8）。與文獻[31]對照，其波譜數據基本一致，故確定該化合物為染料木黃酮（Genistein）。

2.4.2 化合物2 黃色油狀物，ESI-MS:m/z491[M+H]+,分子式為C31H38O5,1H-NMR（CDCl3,500 MHz）,δ：1.25（3H,s,H-13）,1.39（3H,s,H-18）,1.48（3H,s,H-12）,1.53（3H,s,H-17）,1.61（3H,s,H-23）,1.68（3H,s,H-22）,2.30（1H,m,H-14β）,2.48（1H,m,H-14α）,2.82（2H,m,H-11）,3.00（1H,m,H-19β）,3.08（1H,m,H-19α）,3.20（2H,m,H-10）,3.71（3H,s,-OCH3）,4.80（1H,t,J=8.0 Hz,H-15）,5.00（1H,t,J=7.1 Hz,H-20）,5.69（1H,d,J=10.3 Hz,H-3）,6.18（1H,d,J=10.3 Hz,H-4）,6.75（1H,d,J=8.6 Hz,H-3′）,6.75（1H,d,J=8.6 Hz,H-5′）,7.13（1H,d,J=8.6 Hz,H-2′）,7.13（1H,d,J=8.6 Hz,H-6′）,18.8（1H,s,7-OH）.13C-NMR（CDCl3）δ:18.1（C-18）,18.3（C-22）,21.6（C-19 α and β）,26.1（C-23）,26.3（C-17）,29.1（C-12）,29.9（C-13）,30.6（C-11）,42.1（C-10）,45.0（C-14 α and β）,53.2（C-4a）,55.7（4′-OCH3）,82.7（C-2）,108.5（C-6）,114.2（C-3′）,114.2（C-5′）,115.6（C-8）,117.7（C-15）,123.3（C-20）,123.7（C-4）,129.9（C-6′）,129.9（C-2′）,132.0（C-3）,132.1（C-21）,133.8（C-1′）,137.2（C-16）,158.3（C-4′）,168.6（C-8a）,190.0（C-7）,193.9（C-5）,202.4（C-9）,與文獻[32]對照，其波譜數據基本一致，故確定該化合物為Philippin C。

2.4.3 化合物3 黃色油狀物，ESI-MS:m/z491[M+H]+,分子式為C31H38O5，1H-NMR（CDCl3,500 MHz）,δ:1.35（3H,s,H-12）,1.35（3H,s,H-13）,1.58（3H,s,H-17）,1.58（3H,s,H-18）,1.58（3H,s,H-22）,1.58（3H,s,H-23）,1.74（2H,t,J=6.7 Hz,H-3）,2.41（2H,t,J=6.7 Hz,H-4）,2.66（2H,m,H-14α and β）,2.66（2H,m,H-19α and β）,2.95（2H,m,H-11）,3.23（2H,m,H-10）,3.82（3H,s,4′-OCH3）,4.81（1H,m,H-15）,4.81（1H,m,H-20）,6.86（1H,d,J=8.4 Hz,H-3′）,6.86（1H,d,J=8.4 Hz,H-5′）,7.15（1H,d,J=8.4 Hz,H-2′）,7.15（1H,d,J=8.4 Hz,H-6′）,18.3（1H,s,7-OH）.13C-NMR（CDCl3）δ:21.6（C-17 and 23）,29.3（C-12 and 13）,32.3（C-18 and 22）,33.8（C-11）,41.2（C-14 and 19）,45.5（C-10）,58.9（4′-OCH3）,60.6（C-8）,84.8（C-2）,109.7（C-4a）,111.4（C-6）,117.4（C-3′ and 5′）,118.1（C-4）,121.7（C-15 and 20）,126.8（C-3）,133.0（C-2′ and 6′）,137.0（C-1′）,138.3（C-16 and 21）,161.4（C-4′）,176.0（C-8a）,189.7（C-5）,198.8（C-7）,205.5（C-9）,與文獻[33]對照，其波譜數據基本一致，故確定該化合物為Philippin D。

2.4.4 化合物4 黃色油狀物，ESI-MS:m/z509[M+H]+,分子式為C31H40O6,1H-NMR signals at δ 3.10（1H,m,H-19），3.00（1H,dd,J=7.5,14.5 Hz,H-19）,5.11（1H,t,J=7.5 Hz,H-20）,1.72（3H,s,H-22）and 1.68（3H,s,H-23），δ 2.50（1H,dd,J=8.0,14.0 Hz,H-14）,2.39（1H,dd,J=7.5,14.0 Hz,H-14）,4.96（1H,t,J=7.5 Hz,H-15）,1.66（3H,s,H-17）and 1.52（3H,s,H-18），4.51（1H,dd,J=6.5,10.0 Hz,H-2）.13C-NMR（CDCl3）δ:17.8（C-18）,21.5（C-19）,23.8（C-13）,25.6（C-23）,25.8（C-17）,26.6（C-12）,30.6（C-3）,31.0（C-10）,40.0（C-9）,55.2（4′-OCH3）,60.6（C-3a）,71.2（C-11）,90.5（C-2）,106.5（C-7）,107.3（C-5）,113.7（C-2′）,113.8（C-6′）,117.1（C-15）,129.4（C-3′）,129.4（C-5′）,132.1（C-21）,133.3（C-1′）,137.0（C-16）,158.0（C-4′）,175.1（C-4）,192.3（C-6）,與文獻[34]對照，其波譜數據基本一致，故確定該化合物為Flemiphilippinone A。

2.5 四種黃酮化合物對乙酰膽堿酯酶的抑制活性

黃酮類化合物對AChE抑制作用主要由苯環、酮羰基及和芐基等官能團決定，且分子量要與典型化合物相似，能同時與AChE中心和外周兩個活性位點發生結合，才可擁有較強的抑制活性。而常見的生物堿AChE抑制劑如多奈哌齊、利伐司替明等抑制劑僅可結合乙酰膽堿酯酶的一個活性位點，黃酮化合物對乙酰膽堿酯酶的抑制活性具有一定的結構優勢。

為研究蔓性千斤拔中黃酮化合物抑制乙酰膽堿酯酶的機理，在整個實驗過程中，始終保持酶濃度的恒定，選擇不同底物濃度，將得到反應過程的吸光度隨時間變化曲線，得到米氏方程曲線如圖5 所示。由圖5 可以看出，在相同底物濃度條件下，化合物3 的反應速率>化合物2 的反應速率>化合物4 的反應速率>化合物1 的反應速率，原因可能在于異戊二烯基團在空間的同側更易于與酶結合，使得抑制活性增強。同時，所有化合物參與的酶促反應速率提高的原因是底物濃度非線性增加，這種趨勢，符合米氏方程規律，因此可以通過米氏方程相關的酶動力學試驗，對蔓性千斤拔根中黃酮化合物對AChE的抑制類型進行測定。

圖5 不同濃度類黃酮對AChE的米氏方程曲線Fig.5 The Michaelis-Menten curve of AChE under different concentrations of purified flavonoids

2.6 四種黃酮化合物對乙酰膽堿酯酶抑酶動力學分析

蔓性千斤拔黃酮化合物對乙酰膽堿酯酶抑制過程中，整個酶促反應符合米氏方程，可通過雙倒數作圖法（Lineveaver-Burk），以四種黃酮化合物在不同濃度下測得AChE催化反應倒數對底物濃度倒數關系作圖。

在抑制劑可逆抑制類型中，根據底物、酶和抑制劑的關系可分為競爭性抑制、非競爭性抑制、反競爭性抑制和混合型抑制四種不同類型。可通過雙倒數曲線判斷抑制類型[35]。利用雙倒數作圖法，以不同濃度的化合物1～4 測得AChE催化反應速率倒是（1/[v]）對底物濃度的倒數（1/[s]）作圖，如圖6～圖9所示。

圖6 化合物1 對AChE抑制作用雙倒數曲線Fig.6 Double reciprocal curve of compound 1 inhibitory effect on AChE

圖7 化合物2 對AChE抑制作用雙倒數曲線Fig.7 Double reciprocal curve of compound 2 inhibitory effect on AChE

圖8 化合物3 對AChE抑制作用雙倒數曲線Fig.8 Double reciprocal curve of compound 3 inhibitory effect on AChE

圖9 化合物4 對AChE抑制作用雙倒數曲線Fig.9 Double reciprocal curve of compound 4 inhibitory effect on AChE

由圖6～圖9 可知，在無抑制劑和加入不同濃度的抑制劑（化合物1～4）條件下，幾條直線均相交于第二象限，且在X坐標軸和Y坐標軸交點都不同，乙酰膽堿酯酶的表觀米氏常數（Km）隨著類黃酮濃度的增加而增加，而最大的酶促反應速率在減小，根據以上實驗結果，從抑制劑可逆抑制動力學特征得出，從蔓性千斤拔中分離的化合物1～4，對乙酰膽堿酯酶的抑制行為是混合型抑制，表明類黃酮既可以和酶單獨結合，也可以與酶和底物復合物結合，抑制酶的催化活性[35]。抑制常數Ki可通過雙倒數曲線求得，且化合物1～4 的半抑制濃度（IC50），如表1 所示。

表1 分離的化合物1～4 對乙酰膽堿酯酶的抑制作用Table 1 Inhibitory effect of isolated compounds 1～4 on acetylcholinesterase

3 結論

通過不同溶劑系統富集蔓性千斤拔的主要化學成分總酚和總黃酮，結果表明甲醇作為溶劑對于總酚和總黃酮提取率最高，正丁醇、氯仿和乙酸乙酯提取物無明顯差別，水提取物提取率最低。再利用不同溶劑提取物對乙酰膽堿酯酶的抑制作用進行試驗，實驗結果與提取試驗呈正相關趨勢，甲醇提取物抑制效果最佳。

將甲醇提取物通過柱層析等分離手段進行系統純化，利用NMR和EI-MS等分析手段，鑒定出4 種類黃酮化合物，并對四種類黃酮對乙酰膽堿酯酶抑制作用進行深入研究，結果表明，四種化合物對乙酰膽堿酯酶的抑制類型為混合型，半抑制濃度（IC50）在（57.86±0.67）～（127.28±1.22）μmol/L之間，抑制常數Ki為（54.8±0.43）～（120.58±1.35）μmol/L。實驗結果表明，蔓性千斤拔提取物及其含有的類黃酮化合物能夠較好的抑制乙酰膽堿酯酶的活性，具有較大的應用潛質，該研究可為植物源活性分子對神經退行性疾病改善的研究提供理論基礎，為蔓性千斤拔的生理活性的拓展和功能產品的開發打下基礎。