響應面法優化鹿骨多肽酶解工藝及其體外抗氧化活性

揣欣欣，郭冰潔，劉露露，牛紅梅，馬 月，張亞麗，劉小瑜，苑廣信,

（1.北華大學藥學院,吉林吉林 132013；2.北京亦度正康健康科技有限公司,北京 100055）

近年來，生物活性肽由于在代謝調節中具有非常重要的作用而倍受關注，并且也越來越多的被用作功能性食品成分、保健食品和藥物，以改善人體健康并預防疾病[1]。鹿骨是鹿科動物梅花鹿（Cervus hortulorum）或馬鹿（Cervus elaphus）的骨骼，含有大量的優質蛋白，對人體無毒副作用，具有廣泛的藥理活性和醫用保健功能，能補腎壯陽，祛風除濕，對體弱、精髓不足、風濕、四肢疼痛有較好的療效，可作為天然活性蛋白多肽的可靠來源[2?5]。有研究表明，多肽在抗氧化方面具有優異的活性，是天然的抗氧化劑，能預防或減輕人體氧化應激引發的衰老、免疫疾病及其他各類疾病[6?10]。鹿骨多肽是鹿骨蛋白經過酶解得到的產物，因其比鹿骨蛋白水溶性更好，更易被人體吸收一直備受關注[11]。張鶴等[12?16]發現梅花鹿膠原蛋白、鹿骨膠原蛋白、豬骨多肽、鱈魚骨蛋白肽、馬面魚骨膠原混合肽均具有良好的抗氧化活性。本文選用對鹿骨蛋白進行雙酶酶解的方式得到鹿骨多肽，并基于鹿骨多肽的水解度，通過響應面法篩選出胃蛋白酶和胰蛋白酶的最佳酶解工藝，驗證其抗氧化活性，為今后鹿骨多肽的開發與利用提供了理論依據。

本文首先利用熱水抽提法提取鹿骨膠，然后采用硫酸銨鹽析法提取出提取液中的蛋白，并根據在不同提取溫度條件下蛋白濃度的多少篩選出最優的提取溫度。然后將蛋白依次用胃、胰蛋白酶水解，通過單因素及響應面實驗設計，根據水解度（DH）篩選鹿骨多肽的最佳酶解工藝，并檢測雙酶酶解后的多肽的體外抗氧化功能，以期為鹿骨多肽的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鹿骨 吉林市向陽鹿廠；抗壞血酸（VC）、硫酸銨、水楊酸 天津市永大化學試劑有限公司；BCA試劑盒、Folin-酚試劑盒、胃蛋白酶（1:3000）、胰蛋白酶（1:250）北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）東京化成工業株式會社；硫酸亞鐵 遼寧泉瑞試劑公司。

Eppendorf臺式離心機冷凍干燥機 美國SP Scientific-Vritis BenchTop Pro；Infinite M200 型酶標儀 瑞士TECAN集團公司；Five Easy plus型pH計 瑞士Mettler Toledo；5430R低溫高速離心機 美國Eppendorf公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鹿骨蛋白制備及酶解工藝 除去鹿骨上肉、筋膜等非骨物質，在石油醚中脫脂后揮干，在0.5 mol/L的HCl中脫鈣并采用EDTA滴定法測定酸液中的鈣含量[17]。確定完成脫鈣后用水洗至中性，室溫干燥處理后將脫脂脫鈣骨在一定溫度下，料液比為1:10 條件下提取3 h，提取三次，合并提取液，在4 ℃的溫度條件下緩慢加入硫酸銨粉末至終濃度達到80%，在4.0×103r/min的條件下離心15 min后將沉淀復溶，用透析袋透析除鹽24 h，冷凍干燥得到鹿骨蛋白粉末。在底物濃度（蛋白質量與溶液體積的比）為4%，酶用量、溫度、pH和時間一定時進行胃蛋白酶酶解，冷凍干燥得到的蛋白粉末再進行胰蛋白酶酶解，底物濃度為4%，酶用量、溫度、pH一定，酶解一定時間后將樣品放入沸水中煮15 min，終止酶解，并進行冷凍干燥得到鹿骨多肽粉末。

1.2.2 鹿骨蛋白提取溫度的篩選 在上述條件下，設置提取溫度分別為65、95、121 ℃，其中65 ℃為鹿骨膠原蛋白變性的臨界溫度[18]，95 ℃下提取的鹿骨蛋白具有良好的抗氧化活性，121 ℃為藥典中鹿骨成藥鹿骨多肽的提取溫度，以提取所得鹿骨蛋白的蛋白濃度為指標篩選最佳提取溫度。鹿骨蛋白的蛋白濃度測定方法：利用BCA試劑盒對鹿骨蛋白含量進行檢測。蛋白標準曲線為Y=0.00056X+0.02607（R2=0.99549），并比較三種溫度提取鹿骨蛋白的蛋白濃度，篩選出最佳提取溫度。

1.2.3 胃蛋白酶酶解鹿骨蛋白工藝的響應面優化前期進行了單因素實驗，在底物濃度為4%的條件下，依次改變酶用量、酶解溫度、pH、酶解時間根據水解度變化得到單因素實驗結果。在單因素實驗基礎上，以水解度為衡量標準，如表1所示，設計4 因素3 水平響應面分析實驗。

表1 響應面分析法優化胃蛋白酶解工藝Table 1 Optimization of pepsin hydrolysis process by response surface methodology

1.2.4 胰蛋白酶酶解鹿骨蛋白工藝的響應面 優化取胃蛋白酶酶解后的蛋白凍干粉末，用胰蛋白酶繼續水解。前期進行了單因素實驗，在底物濃度為4%的條件下，依次改變酶用量、酶解溫度、pH、酶解時間根據水解度變化得到單因素實驗結果。在單因素實驗基礎上，以水解度為衡量標準，如表2所示，設計4 因素3 水平響應面分析實驗。

表2 響應面分析法優化胰蛋白酶解工藝Table 2 Optimization of trypsin hydrolysis process by response surface methodology

1.2.5 水解度的測定 取鹿骨蛋白酶解液3 mL加入等體積的10%三氯乙酸（TCA）溶液，充分混勻，切斷蛋白的肽鏈，靜置30 min，在4.0×103r/ min的條件下離心15 min，取上清液，用BCA試劑盒對游離態氮的含量進行測定[19]。

式中：DH：水解過程中被裂解的肽鍵數與給定蛋白質的總肽鍵數之比；N0：蛋白質水解前上清液中TCA可溶性氮含量（mol/L）；N1：蛋白水解后上清液TCA可溶性氮含量（mol/L）；N2：蛋白總氮含量（mol/L）。

1.2.6 鹿骨多肽抗氧化性的測定

1.2.6.1 DPPH自由基清除率的測定 吸取不同濃度樣品100 μL于96 孔板中，加入100 μL 0.2 mmol/L DPPH溶液，充分搖勻并避光處理，于25 ℃的條件下孵育30 min，在517 nm處測定吸光度值抗壞血酸為陽性對照藥，每組各做3 個平行樣，避光操作[20?22]。

式中：Ai：加入樣品和DPPH的吸光度值；Aj：加入樣品和無水乙醇的吸光度值；A0：加入水和DPPH的吸光度值；A空白：加入水和無水乙醇的吸光度值。

1.2.6.2 羥自由基清除率的測定 在96 孔板中加入50 μL不同濃度樣品，并依次吸取H2O2溶液、FeSO4溶液均50 μL于96 孔板中，避光搖勻10 min，再加入50 μL水楊酸啟動反應，于37 ℃的條件下孵育30 min，510 nm處測定吸光度值，抗壞血酸為陽性對照藥；每組各做3 個平行樣[23?24]。

式中：Ai：加入樣品+FeSO4+H2O2+水楊酸的吸光度值；Aj：加入樣品+FeSO4+水+水楊酸的吸光度值；A0：水+FeSO4+H2O2+水楊酸吸光度值。

1.3 數據處理

各組數據均采用Graphpad Prism 7.0 進行分析處理，Design Experts 8.0.6 進行分析，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 提取溫度對鹿骨蛋白提取效果的影響

提取溫度在蛋白提取過程中具有很重要的影響，提取溫度過高時蛋白可能失去分子活性，提取溫度過低，則提取不完全，因此選擇最適的蛋白提取溫度至關重要[25]。三種溫度提取鹿骨蛋白的蛋白濃度結果如圖1 所示，最佳提取溫度為95 ℃，此時鹿骨蛋白的蛋白濃度最高，達到73.43%，高于121 ℃和65 ℃時提取出的鹿骨蛋白的蛋白濃度57.53%和69.87%，且此條件下提取所得的蛋白濃度高于郭冰潔等[26]121 ℃提取的鹿骨蛋白的蛋白濃度（51.2%），所以確定95 ℃為最佳提取溫度。

圖1 提取溫度對蛋白濃度的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on protein concentration

2.2 胃蛋白酶水解工藝優化結果

本研究在單因素實驗結果基礎上，利用多元二次回歸方程擬合因素與響應值之間的函數關系，通過對回歸方程的分析解決多變量問題，尋求最佳酶解工藝[27?29]，前期實驗得到胃蛋白酶水解單因素最佳條件為：酶用量5500 U/g，溫度37 ℃，pH2.0，時間3 h。根據響應面結果表3 及方差分析結果表4 可知，模型P<0.0001，F=34.93，且失擬項P=0.1759>0.05，說明模型高度顯著，擬合度較高，理論值與實際值呈一定的相關性（R2=0.9722），模型調整系數RAdj2=0.9443，說明該模型可以解釋94.43%的響應值變化，所得實驗結果真實可靠。同時，X1對響應面值有顯著的影響（P<0.05），X2、X3、X1X3、X12、X22、X32和X42對響應面值都有極顯著的影響（P<0.01）。各因素影響程度依次為：溫度>pH>酶用量>時間。建立了二次多項回歸模型：

表3 響應面設計方案及結果Table 3 Design and results of response surface experiment

表4 響應面回歸方程方差分析Table 4 Variance analysis of response surface regression equation

響應面的坡度可以直觀地呈現出反應條件對響應值的敏感度。由圖2 可知，酶用量、溫度、pH對水解度均有顯著的影響，在各因素水平范圍內，酶用量與pH具有極顯著的交互作用（P<0.01），與酶用量相比，pH對水解度影響程度更大，酶用量與時間對水解度影響較小，且二者交互作用不明顯。溫度與pH對水解度影響較大，酶解時間對水解度的影響較小。

圖2 胃蛋白酶參數對水解度的影響Fig.2 Effect of pepsin parameter on hydrolysis degree

通過對回歸模型分析，得出最大水解度為11.52%，胃蛋白酶最佳工藝為：酶用量6121.05 U/g，溫度37.31 ℃，pH2.05，時間3.18 h。為進一步確定鹿骨多肽酶解工藝的最佳條件，對各試驗參數進行優化，得到胃蛋白酶最佳工藝為：6200 U/g，溫度37.3 ℃，pH2.0，時間3.2 h，重復3 次進行驗證，實際水解度值為11.23%。與理論值非常接近，證明應用響應面法優化胃蛋白酶酶解工藝方法可行、可靠。

2.3 胰蛋白酶水解工藝優化結果

前期實驗得到胰蛋白酶水解單因素最佳條件為：酶用量6000 U/g，溫度37 ℃，pH8.0，時間4 h。由響應面結果表5 及方差分析結果表6 可知，模型P<0.0001，F=60.75，且失擬度P=0.1192>0.05，說明該模型高度顯著，且擬合度較高，理論值與實際值呈一定的相關性（R2=0.9838），模型調整系數RAdj2=0.9676，說明該模型可以解釋96.76%的響應值變化，所得實驗結果真實可靠。同時，X1和X2X3對響應面值有顯著的影響（P<0.05），X2、X3、X1X3、X12、X22、X32和X42對響應面值都有極顯著的影響（P<0.01）。各因素影響程度依次為：溫度>pH>酶用量>時間。建立了二次多項回歸模型：

表5 響應面設計方案及結果Table 5 Design proposal and experiment result of response surface

表6 響應面回歸方程方差分析Table 6 Response surface regression equation analysis of variance

由圖3 可知，因素水平范圍內，酶用量、溫度、pH對水解度均有顯著的影響，酶用量與pH具有顯著的交互作用（P<0.01），溫度與pH具有顯著的交互作用（P<0.05），酶用量與時間交互作用很小。與酶用量相比，pH對水解度影響程度更大?？傊附鈺r間與酶用量對水解度影響較小，溫度和pH對水解度影響較大。

圖3 胰蛋白酶參數對水解度的影響Fig.3 Effect of trypsin parameter on hydrolysis degree

通過對回歸模型分析，得出最大水解度為23.55%，胰蛋白酶最佳工藝為：酶用量6263.47 U/g，溫度37.25 ℃，pH8.10，時間4.07 h。為進一步確定鹿骨多肽酶解工藝的最佳條件，對各試驗參數進行優化，得到胰蛋白酶實際最佳工藝為：酶用量6300 U/g，溫度37.2 ℃，pH8.1，時間4.0 h，重復3 次進行驗證，實際水解度值為23.09%，與理論值接近，說明該模型可獲得胰蛋白酶水解工藝的最優條件。

2.4 鹿骨多肽體外抗氧化結果

2.4.1 鹿骨多肽對DPPH自由基的清除能力 鹿骨多肽可有效的清除試驗體系中的DPPH自由基，VC水溶液對DPPH的清除效果非常顯著，如圖4，與VC相比，鹿骨多肽在0～6 mg/mL清除率與鹿骨多肽濃度呈劑量依賴關系，隨鹿骨多肽濃度增加，清除率迅速升高，6～10 mg/mL時，清除率增加趨于平緩，鹿骨多肽濃度為10 mg/mL時，最大清除率為74.63%，其IC50=3.72 mg/mL。

圖4 鹿骨多肽對DPPH自由基的清除率Fig.4 The scavenging rate of the deer bone polypeptide on DPPH free radical

2.4.2 鹿骨多肽對羥自由基的清除能力 鹿骨多肽對試驗體系中的羥自由基有顯著的清除作用（P<0.05），如圖5 所示，VC水溶液對DPPH的清除效果非常顯著，與VC相比，當鹿骨多肽質量濃度小于4 mg/mL時，隨著鹿骨多肽濃度增加，羥自由基的清除率迅速升高；當濃度大于4 mg/mL時，清除率平緩升高，在10 mg/mL時達最大清除率87.02%，其IC50=2.24 mg/mL。

圖5 鹿骨多肽對羥自由基的清除率Fig.5 The scavenging rate of the deer bone polypeptide on ?OH

3 結論

在本研究中，在提取溫度為95 ℃時，鹿骨蛋白中的蛋白濃度最高，達到73.43%。通過對胃蛋白酶水解工藝進行響應面優化及實際驗證確定了胃蛋白酶酶解最佳工藝為：6200 U/g，溫度37.3 ℃，pH2.0，時間3.2 h，此時的實際水解度值為11.23%。同法優化胰蛋白酶最佳工藝及實際驗證確定了在酶用量6300 U/g，溫度37.2 ℃，pH8.1，時間4.0 h的條件下胰蛋白酶酶解最佳，其實際水解度值為23.09%。并通過體外抗氧化實驗表明，鹿骨多肽對DPPH自由基、羥自由基具有良好的清除能力，在一定范圍內，對自由基的清除能力呈劑量依賴關系，其IC50值依次為：3.72、2.24 mg/mL，說明鹿骨多肽具有良好的抗氧化活性。