黃精與土霉素協同抑制副溶血弧菌研究

操慶國，郭 欽，蔡佳惠，陳 會，賈 君

（1.江蘇農林職業技術學院茶與食品科技學院,江蘇句容 212400；2.江蘇大學食品與生物工程學院,江蘇鎮江 212013）

2013 年，全球甲殼類水產養殖產值已超過130 億美元[1]。然而，甲殼類水產養殖業卻面臨著巨大的風險。來自海洋的弧菌，如副溶血弧菌、創傷弧菌（V.vulnificus）、哈維氏弧菌（V.harveyi）、溶藻弧菌（V.alginolyticus）和鰻弧菌（V.anguillarum）等，能引起11 種細菌性疾病，從而給水產養殖尤其是對蝦養殖業造成巨大的損失。其中，副溶血弧菌是急性肝胰臟壞死病（acute hepatopancreatic necrosis，AHPND）或早期死亡綜合征（early mortality syndrome，EMS）的主要病原菌，可使對蝦發生組織病理學改變，包括肝胰腺功能障礙、空腹和空腸、軟殼和萎縮的肝胰臟等。從2009 年開始，AHPND每年造成全球將近10 億美元的損失，目前有11 個國家已經加入“降低和管理養殖蝦的AHPND風險”計劃。

由于水產弧菌病頻發，為了殺滅副溶血弧菌，許多抗菌藥物被開發和應用，包括抗生素類、陽離子抗菌肽、益生菌和中草藥復方制劑等[2]。然而這些都只能作為輔助手段，單獨應用效果較差。到目前為止，抗生素仍然是治療AHPND最為廣泛和最有效的措施，但抗生素濫用帶來的殘留風險和多重耐藥性菌株的出現對環境造成惡劣的影響，并對人類健康帶來極為嚴重的威脅。據報道，副溶血弧菌的抗藥譜非常廣，并隨國家和地區的不同而有所區別，其主要耐受的抗生素包括氯霉素類、β-內酰胺類、四環素類、氨基糖苷類和喹諾酮類等，其中，β-內酰胺類耐受性將近100%[3]。近年來世界各地出現多重耐藥副溶血弧菌，對全球對蝦養殖產業和人類健康帶來巨大威脅，因此開發環境友好的、安全無毒的殺菌劑勢在必行。已有多種天然產物被開發，如中草藥復方制劑、殼聚糖、β-葡聚糖、大蒜和洋蔥提取物、海草提取物、混合植物精油等[4?6]。由于天然產物在實際應用中單獨抑菌效果較弱，因此尋找能和抗生素協同作用、降低抗生素使用濃度，縮小抗性風險的天然產物成為研究熱點。國內外已報道多種可以和抗生素聯用協同抑菌的天然植物，其中絕大部分屬于外排泵抑制劑，如胡椒堿、防己堿、茶多酚、植物精油、氧化白藜蘆醇、香芹酚和水飛薊等[7?9]。它們以外排泵為靶點，如NorA、MexAB-OprM、Msr（A）、Tet（K）等，降低細菌對抗生素的外排，從而增強細菌對抗生素的敏感性，抑制多重耐藥金黃色葡萄球菌（MRSA）、鮑曼不動桿菌、多重耐藥假單胞菌和大腸桿菌等致病菌的生長[10]（Bucar 2015）。

細菌有多種對抗抗生素壓力的機制，如抗生素酶降解、核糖體保護蛋白、細胞膜滲透性屏障、外排泵作用和可移動基因元件等。其中，外排泵作用是研究最為廣泛的一種耐藥機制[7]。細菌通常都具有一個或多個外排泵，能將抗生素排出體外，主要包括耐藥結節分裂子（resistance-nodulation-division，RND）、主要促進者超級家族（major facilitator superfamily，MFS）、多重藥物和毒物排出（multidrug and toxic compound extrusion，MATE）、小的多重藥物抗性（small multidrug resistance，SMR）以及ATP結合盒膜轉運蛋白（ATP-binding cassett transporter，ABC轉運子）五種類型[5]。目前，尋找細菌外排泵抑制劑已成為研究熱點，安全無毒、藥食同源的天然植物是外排泵抑制劑（EPIs）的最佳來源，已經有多篇相關研究報道[11?13]。

黃精（Polygonatum sibiricumRed.）是我國傳統中藥，其化學成分包括多糖、皂苷、黃酮、生物堿、醌類化合物、木脂素和多種人體必需氨基酸，具有抗衰老、降血糖、降血脂、改善記憶力、調節免疫和抗腫瘤等作用[14?15]。

天然產物由于成分復雜，單獨作用效果較差，因此本文通過黃精和抗生素聯用抑制副溶血弧菌，研究其協同機制，發現其可作為外排泵抑制劑，降低抗生素殺菌濃度，減少副溶血弧菌抗藥性的產生，從而降低水產養殖中抗生素殘留風險，為對蝦的健康養殖提供科學數據和理論基礎，保證對蝦食品安全。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

副溶血弧菌RIMD2210633 實驗室保存；黃精 鎮江存仁堂；中國《水產養殖用藥指南》規定可以在水產養殖中應用的八種抗生素，分別為氨基糖苷類（硫酸新霉素）、喹諾酮類（諾氟沙星、恩諾沙星和噁喹酸等）、酰胺醇類（氟苯尼考和甲砜霉素）、四環素類（土霉素和鹽酸多西環素）、羰基氰化物間氯苯腙（CCCP）上海源葉生物科技有限公司；RNAprep Pure細菌總RNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR? Premix Ex Taq? II（Tli RNaseH Plus）、DNA Maker寶日醫生物技術（北京）有限公司；堿性磷酸酶試劑盒 碧云天生物公司；LB肉湯、TCBS瓊脂 北京陸橋技術有限責任公司；MH肉湯 青島海博生物技術有限公司；蘋果酸脫氫酶（MDH）試劑盒、琥珀酸脫氫酶（SDH）試劑盒南京建成生物工程研究所；其他試劑 皆為分析純，上海國藥集團。

Infinite 200 多功能酶標儀 瑞士Tecan公司；TCS SP5 II激光共聚焦顯微鏡 德國 Leica公司；DDS-11A數顯電導率儀 上海雷磁·創益儀器儀表有限公司；CFX96 實時熒光定量PCR儀 美國寶特公司（Bio-Rad）。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃精水提取制備 黃精打粉，過100 目篩。取25 g粉末，200 mL蒸餾水浸泡過夜，55 ℃、180 W超聲1 h，靜置至室溫，4 層紗布過濾藥液，200 mL蒸餾水清洗3 遍殘渣，過濾后與濾液合并，旋轉蒸發儀55 ℃、60 r/min加熱濃縮濾液至約20 mL，定容，濃度為1 g/mL，4 ℃保存備用。

1.2.2 CCCP的配制 取1.5 mL的離心管一只，稱取10 mg的CCCP粉末溶解于1 mL的甲醇中，混勻，配制成濃度為10 mg/mL的CCCP溶液。

1.2.3 抗生素的配制 取1.5 mL離心管，分別標記8 種抗生素，各自稱取12.8 mg的相應抗生素，溶解于1 mL的相應溶劑中，配制成最終濃度為12.8 mg/mL的抗生素溶液，0.22 μm過濾除菌，4 ℃保存備用。

1.2.4 黃精和抗生素單獨抑制副溶血性弧菌的最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）測定 通過肉湯微量稀釋法評估黃精和抗生素單獨抑菌效果，采用96 孔板法測定MIC。副溶血弧菌在LB+3% NaCl液體培養基（LBNB）中37 ℃培養過夜，0.5 麥氏比濁管校正濃度。含有副溶血性弧菌的Mueller-Hinton+3% NaCl液體培養基（MHB）用作陽性對照，僅含有黃精或抗生素或CCCP的MHB作為陰性對照。在96 孔板中，對藥物用MHB進行連續兩倍的梯度稀釋，使抗生素含量為128～0.25 μg/mL；羰基氰化氯苯腙（CCCP）濃度為10～1.25 μg/ mL，黃精水提物濃度分別為 200000～195.31 μg/mL，每個孔中加入90 μL菌液，使總體積為200 μL，菌液濃度為5×105CFU/mL，37 ℃搖床振蕩培養24 h，觀察副溶血性弧菌的生長情況。無細菌生長的最低濃度定義為MIC。

1.2.5 黃精和抗生素聯合抑制副溶血性弧菌的抑菌濃度指數（Fractional Inhibitory Concentration，FIC）測定 采用棋盤微量肉湯稀釋法測定黃精和抗生素的聯合抑菌效果。以土霉素和黃精為例，96 孔板縱排依次為MHB稀釋后濃度為 MIC～1/16 MIC黃精，橫排依次為MIC～1/16 MIC土霉素，使得每孔中都有不同濃度的黃精水提物和土霉素混合溶液，之后每孔中加入90 μL菌液，使總體積為200 μL，細菌終濃度為5×105CFU/mL，分別設置無藥物只含有細菌的培養基和空白培養基作為陰性對照和空白對照，37 ℃培養24 h觀察結果，以細菌無生長的最低濃度定義為協同MIC（SMIC）。其他抗生素采用相同步驟進行。

FIC=MIC協同/MIC黃精單用+MIC協同/MIC抗生素單用

式中，FIC≤0.5 為協同作用；0.52 為拮抗作用。

1.2.6 黃精對副溶血弧菌細胞膜的影響

1.2.6.1 電導率檢測 副溶血性弧菌在LBNB中37 ℃培養過夜，取100 μL菌液移至含有1/2MIC黃精的5 mL LBNB試管中，加菌和空白不加菌的LBNB作為對照，37 ℃下培養8 h，分別在0、1、2、4、6 和8 h取出5 00 μL培養物，5000 r/min離心10 min，取上清液100 μL加3.9 mL水進行稀釋，測定上清液的電導率。

菌液電導率的變化率R（%）計算如下：

1.2.6.2 膜電位檢測 副溶血性弧菌在LBNB中37 ℃培養過夜，取500 μL菌液轉移至含有1/2 MIC黃精提取物的LBNB中。將100 μL混合物加入到96孔板中，加菌和空白不加菌的LBNB作為對照，培養過夜，用5 μmol/ L Bis（1,3-dibutylbarbituric acid）trimethine oxonol（DiBAC4（3））的HEPES檢測緩沖液洗滌96 孔板三次，再加入180 μL DiBAC4（3）的HEPES檢測緩沖液進行碘化丙啶（Propidium iodide，PI）染色，37 ℃孵育30 min，每3 min測量一次熒光強度。

1.2.6.3 細菌存活檢測 采用PI染色法進行。副溶血性弧菌在LBNB中37 ℃培養過夜，取50 μL菌液轉移至5 mL LBNB試管中，37 ℃、180 r/min下培養12 h。將100 μL培養液轉移至含有1/2 MIC黃精的LBNB中，37 ℃振蕩培養3 h，加菌的LBNB為對照。取1 mL液體5000 r/min離心5 min，收集細胞，用PBS洗滌細胞并重懸于200 μL PBS中，加入10 μL PI（1 mg/ mL），混合均勻，37 ℃避光孵育20 min。將染色的細胞滴在蓋玻片上，激光共聚焦顯微鏡下進行觀察。

1.2.7 CCCP對黃精和土霉素聯合抑菌的影響CCCP溶解在丙酮中，濃度為12.5 μg/μL，0.22 μm濾膜過濾除菌。用MHB制備1/2MIC～1/16MIC濃度的CCCP，參照1.2.2 和1.2.3 在不同CCCP條件下評估黃精和抗生素的單獨和聯合抑菌效果。將無細菌生長的最低濃度分別定義為CCCP-單獨MIC（CMIC）和CCCP-協同MIC（CSMIC）。

1.2.8 RT-PCR將100 μL過夜培養物轉移至5 mL含有1/2 MIC黃精的LBNB中，加菌的LBNB為對照，37 ℃、180 r/min振蕩培養12 h。取出1 mL菌液，提取總RNA，并反轉錄為cDNA，進行RTPCR檢測。反應體系：10 μL SYBRPremix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus），2 μL cDNA，6.4 μL無RNase ddH2O，0.8 μL正向和反向引物，共25 μL。反應條件為：95 ℃ 30 s，95 ℃變性5 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40 個循環。溶解曲線從65 ℃升至95 ℃，每5 s改變0.5 ℃。使用16S rRNA作為參比基因，計算目的基因的相對表達量。相對表達量=2??Ct=2?［Ct（目的基因）?Ct（內參基因）］。引物如表1 所示。

表1 研究所用引物Table 1 Primers used in the study

1.2.9 呼吸代謝途徑抑制 參照云寶儀等[16]的方法進行。將3.6 mL PBS（0.1 mol/L，pH 7.2），0.4 mL葡萄糖溶液（1%）和1 mL細菌懸浮液（108CFU/mL）分別加入到四個反應瓶中，振蕩5 min，測量溶解氧含量（初始呼吸速率R0）；分別加入終濃度為500 μg/mL的碘乙酸、500 μg/mL磷酸鈉、500 μg/mL丙二酸和1/2 MIC黃精，測量呼吸率R1；最后，將終濃度為1/2 MIC的黃精分別加入到含有三種抑制劑的LBNB菌液中，確定測量呼吸率R2。整個系統在試驗過程中完全封閉。

式中：IR-呼吸抑制率；DR-呼吸疊加率；R0、R1和R2-對照組和試驗組細菌的呼吸速率（μmol/g/min）。

1.2.10 關鍵酶酶活測定 蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，MDH）和琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）酶活根據所購試劑盒說明進行檢測。

1.3 數據處理

每個試驗做三個平行，重復三次，所有數據為平均值加減標準差。實驗數據用SPSS 19.0t檢驗進行處理，計算方差和顯著性。P<0.05 表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 黃精和抗生素單獨和聯合抑制副溶血性弧菌的MIC

八種抗生素都能抑制副溶血弧菌的生長，其中，抑菌效果最好的是恩諾沙星、諾氟沙星和噁喹酸，MIC皆為0.25 μg/mL，而新霉素效果較差，MIC為16 μg/mL。黃精水提物有一定的抑菌能力，但MIC為50000 μg/mL，遠高于抗生素（表2）。

表2 黃精和抗生素單獨抑制副溶血弧菌的MICTable 2 MICs of Polygonatum sibiricum Red.and antibiotics against V.parahaemolyticus alone

當1/4MIC黃精和八種抗生素聯用時，土霉素展現出較好的協同抑菌作用，MIC降低4 倍，SMIC變為1/4MIC（0.5 μg/mL），FIC為0.5；其他七種抗生素的MIC均沒有變化，FIC皆為1.25，表明缺乏協同抑菌能力（表3）。因此，不同濃度土霉素和黃精組合的協同抑菌能力被進一步研究。表4 表明，隨著黃精水提物濃度的降低，協同抑菌所需土霉素濃度逐漸增大，具有最佳協同抑菌效果的配比為1/8 MIC黃精+1/4 MIC土霉素，此時FIC最小，為0.38。

表3 抗生素聯合1/4MIC黃精對副溶血弧菌的協同SMIC 和FICTable 3 FIC and SMICs of P.sibiricum Red.in combination with antibiotics against V.Parahaemolyticus

表4 不同濃度土霉素和黃精聯合抑制副溶血弧菌的MIC和FICTable 4 FIC and SMICs of P.sibiricum Red.in combination with oxytetracycline against V.Parahaemolyticus

2.2 黃精對副溶血弧菌細胞膜的影響

副溶血弧菌屬于革蘭氏陰性菌，由于外膜的存在，與革蘭氏陽性菌相比，更容易產生耐藥性。本實驗選擇電導率、膜電位和PI染色試驗來評估黃精對副溶血弧菌細胞膜的影響。細胞外膜可以轉運多種離子和無機鹽，當外膜受損時，滲透性變大，電解質溢出胞外，因此可以通過測量電導率的變化來判斷細胞膜的損傷程度。與對照組相比，黃精組相對電導率明顯升高，8 h升為5.547 ms/cm，而對照組僅僅略微升高（圖1A），表明黃精可導致細菌膜受損，電解質被釋放到培養液中。

膜電位是細胞膜內部和外部之間的電位差，膜電位的上升和下降分別稱為超極化和去極化。作為膜電位敏感的親脂性陰離子熒光染料，DiBAC4（3）本身沒有熒光，進入細胞后可與胞漿內蛋白質結合，發出熒光，去極化時，DiBAC4（3）進入細胞量增多，熒光強度隨之增加，反之，超極化時熒光強度降低。圖1B表明1/2MIC黃精使副溶血性弧菌細胞膜發生去極化現象，此時Na+通道被激活，大量內流，膜兩側電位差急劇變小。

圖1 黃精對副溶血弧菌細胞膜的影響Fig.1 Effects of P.Rhizoma on the cell membrane of V.Parahaemolyticus

PI是一種核染色試劑，只能通過受損的細胞膜插入雙鏈DNA中，與之結合后并發出熒光，白光下對照組和試驗組的細菌數目幾乎相同，而熒光下黃精組的細胞數遠高于對照組（圖2），表明黃精使得細菌細胞膜嚴重受損，從而導致PI大量進入。

圖2 PI染色圖Fig.2 PI staining

2.3 CCCP對黃精和土霉素聯合抑菌的影響

上述研究結果表明，細胞膜也許是黃精抑菌的主要作用靶點。副溶血弧菌外膜上有多種外膜蛋白和藥物外排泵，能夠單獨或相互結合控制小分子物質如抗生素的進出。為了進一步闡明黃精對細胞外膜的作用，本研究進行了CCCP試驗。CCCP是一種強電子解偶聯劑，可以破壞細胞膜內外跨膜質子梯度，因此抑制大部分依賴質子梯度作為能量的外排泵的表達，屬于外排泵抑制劑[17]。

在不同CCCP濃度下，黃精抑菌的MIC沒有變化，但土霉素的CMIC下降為1/2～1/4MIC，表明副溶血弧菌體內確實存在藥物外排泵（表5）。當CCCP濃度降低到1/8 MIC以下，對土霉素MIC已經沒有影響，所以數據未呈現。由于1/4MIC的CCCP對土霉素的外排影響較小，因此選其作為測試黃精和土霉素聯合抑菌的CCCP濃度。受CCCP的影響，黃精和土霉素的聯合抑菌能力下降，FIC在0.63～1.06之間，此時由協同抑菌變為相加甚至無關作用，說明黃精和土霉素的聯合抑菌機制可能和外排泵相關（表6）。

表5 不同濃度CCCP條件下土霉素和黃精水提物單獨抑制副溶血弧菌的MICTable 5 CMIC of oxytetracycline and P.Rhizoma against V.Parahaemolyticus under different concentrations of CCCP

表6 1/4 MIC CCCP條件下黃精水提物和土霉素聯合抑菌的FIC和MICTable 6 FIC and CSMIC of oxytetracycline in combination with P.Rhizoma against V.Parahaemolyticus under 1/4 MIC CCCP

2.4 黃精對副溶血弧菌外膜蛋白和外排泵表達的影響

通過文獻[18?21]，副溶血弧菌外膜上21 個相關基因被選擇，包括離子泵相關基因vp1228（nhaA，Na+/H+反向協同運輸泵）、vp2072（Na+/H+反向協同運輸泵）、vp2449（VmrA，Na+/藥物反向協同運輸泵）、vp2665（Na+/Ca2+交換蛋白）和vp2867（curA，K+/H+泵），外膜蛋白相關基因vp0425（TolC）、vp1060（TolB）、vpa0096（OmpW）、vpa0318（OmpV）以 及vpa1186（OmpA），RND外排泵相關基因vp0038、vp0941、vp1092、vp1178、vp2472、vpa0344、vpa0363、vpa0471、vpa0480、vpa0809 和vpa1190。

結果表明，21 個基因的表達全被黃精抑制，調控趨勢和土霉素截然相反，卻和CCCP完全一致。其中，vpa0096（OmpW）下 調 497.51 倍，vp0425（TolC）、vp2072（Na+/H+反向協同運輸泵）、vp2665（Na+/Ca2+交換蛋白）、vp1092、vp0941、vp1178、vpa0344和vpa0809 分別下調27.03、73.53、55.56、100.00、35.71、37.74、49.02 和56.18 倍（圖3）。黃精也許和CCCP類似，具有外排泵抑制劑功能，通過下調副溶血弧菌細胞外膜上的vpa0096（OmpW）等基因的表達，達到聯合抑菌的目的。

圖3 相關基因的相對表達倍數Fig.3 Relative expression multiple of related genes

2.5 黃精對副溶血弧菌呼吸代謝途徑的影響

黃精作為一種外排泵抑制劑，可以下調RND外排泵的表達，本文猜測它和CCCP類似，也破壞了跨膜質子梯度，對氧化磷酸化進行解偶聯，從而反饋抑制呼吸代謝，因此檢測了黃精對副溶血弧菌呼吸代謝途徑的影響。

結果表明，黃精可以抑制副溶血弧菌的呼吸代謝作用，抑制率為41.6%±0.036%，與丙二酸的呼吸疊加率最小，為11.3%±0.027%（表7）。呼吸疊加率反映了黃精與三種典型抑制劑共作用時的結果，疊加率越小，說明兩者抑制同一條呼吸代謝途徑的可能性越大，可以推測黃精主要可能通過抑制三羧酸循環（TCA）途徑而起作用。

表7 黃精對副溶血性弧菌呼吸代謝的抑制作用Table 7 Inhibitory effect of P.Rhizoma on respiratory metabolism of V.Parahaemolyticus

TCA循環是指丙酮酸在反應中徹底被氧化脫羧生成能量的過程，TCA循環是微生物體內一切代謝的樞紐，不僅可以產生大量的還原力H和能量，而且能產生多種碳架原料以供給微生物體內的生物合成[22]。MDH和SDH是TCA循環的關鍵酶，MDH能催化蘋果酸變成草酰乙酸，后者是TCA循環的起始的必需物質；SDH則能催化琥珀酸脫氫生產延胡索酸，SDH活性可作為評價TCA循環運行程度的指標。與空白組相比，黃精組MDH和SDH的酶活分別下降為（0.27±0.04）U/mg和（16.70±0.31）U/mg，降低55.30%和33.26%(P<0.05)（表8）。黃精顯著抑制副溶血弧菌TCA循環關鍵酶MDH和SDH的酶活，導致細菌無法得到充足的物質和能量供應，從而加速細菌的死亡。

表8 黃精對副溶血性弧菌TCA關鍵酶酶活的影響Table 8 Effects of P.Rhizoma on the activities of MDH and SDH of V.Parahaemolyticus

3 討論與結論

探討黃精水提物和八種水產抗生素協同抑制副溶血弧菌的作用，并研究了協同抑菌機制。研究發現，黃精和土霉素聯用協同抑菌效果最佳，可使黃精抑菌MIC和土霉素抑菌MIC分別縮減8 倍和4 倍，但這種協同作用在CCCP的影響下趨于消失，變成相加甚至無關，由此本文推斷黃精可能也是一種天然外排泵抑制劑。通過檢測篩選的22 個基因的表達，發現黃精和CCCP類似，能顯著抑制外膜蛋白和RND外排泵的表達，其中8 個基因下調倍數大于30 倍，尤其是vpa0096（OmpW），其表達下調497.51 倍。

副溶血弧菌有6 個外膜蛋白，分別為OmpW、OmpU、OmpV、OmpA、OmpK和TolC[23]。vpa0096（OmpW）位于細菌細胞外膜上，為β桶狀結構，屬于多功能蛋白，主要涉及小分子疏水性物質和鐵離子的運輸以及調節對外界高鹽濃度的抗性，是副溶血弧菌的毒力貢獻基因之一，同時還參與細菌對抗生素和不利環境的耐受[24?25]。黃精破壞副溶血弧菌細胞膜，增加細胞膜滲透性，導致細胞去極化，導致Na+大量回流，同時又顯著抑制vp2072（Na+/H+反向協同運輸泵）和vp2665（Na+/Ca2+交換蛋白）的表達，使得胞內Na+無法被細菌排出體外，而細菌又無法通過提高vpa0096（OmpW）的表達來適應胞內急劇升高的鹽濃度，因此容易死亡。

RND外排泵是一個三聚體，由外排轉運子、膜融合蛋白和外膜蛋白組成，其中TolC是最常見的組成多個RND外排泵的外膜蛋白之一[26]。RND外排泵是副溶血弧菌最主要的藥物外排系統，也是天然外排泵抑制劑主要靶點。副溶血弧菌共有12 個RND外排轉運子[20]，黃精抑制其中11 個轉運子的表達，其中vp1092、vp0941、vp1178、vpa0344 和vpa0809的表達下降最為顯著。當黃精和土霉素聯用，由于RND外排轉運子的表達被顯著抑制，導致土霉素無法排出而在胞內大量聚集，從而提高細菌對土霉素的敏感性，降低土霉素抑菌濃度。同時，土霉素是TolC的底物之一，vp0425（TolC）表達明顯下降，也說明土霉素被阻留在胞內[27?28]。

由于黃精導致細胞膜去極化，同時抑制副溶血弧菌多個Na+/H+反向協同運輸泵，導致胞內外質子梯度被破壞，ATP無法生成，能量以熱量形式散失，質子梯度是RND外排泵的動力來源，這可能是黃精能抑制外排泵表達的原因。由于氧化磷酸化被解偶聯，那么相應的呼吸代謝必然受到影響，黃精通過抑制TCA循環的關鍵酶MDH和SDH，從而抑制副溶血弧菌的TCA循環，進一步加強細菌對抗生素的不耐性，促進細菌死亡。

土霉素屬于四環素類抗生素，其作用機制在于能特異性地與核糖體30S亞基的A位置結合，阻止氨基酰-tRNA在此位置上的連接，從而抑制細菌蛋白質的合成，達到抑菌的目的[29]。黃精和土霉素擁有截然不同的抑菌機制，黃精更能阻留土霉素在細胞內，進一步增強土霉素的抑菌效果，因此能達到協同抑菌的良好效果。

作為和CCCP一樣具有解偶聯功能的外排泵抑制劑，黃精和土霉素聯用能較好地協同抑制副溶血弧菌，與CCCP相比，黃精屬于藥食同源的天然草本，安全無毒，因此具有極具開發潛力，將來能被應用在水產養殖中，降低弧菌耐藥風險，促進水產養殖的健康發展。