柚子全果果酒發酵工藝優化及其抗氧化活性、揮發性成分分析

譚敏華，張巧苑，于立梅,，曾曉房，陳海光

（1.仲愷農業工程學院輕工食品學院，廣東廣州 510225；2.仲愷農業工程學院現代農業工程創新研究院，廣東廣州 510225；3.東莞海關綜合技術中心，廣東東莞 523073）

琯溪蜜柚有“天然罐頭”之稱，其果皮呈黃色，具有清甜微酸、瓤肉潔白等特點，在我國西周時期已有栽培，主要分布在東南沿海地區[1]?，g溪蜜柚不僅含有豐富的營養物質如礦物質、維生素等[2?3]，還能增強人體免疫力和預防疾病的發生[4]，是一種老少咸宜的保健食品。

柚子全果果酒是以柚子皮和瓤肉為原料經破碎等工序釀造而成的低度酒，含有多種抗氧化活性成分和揮發性風味物質，受到人們的青睞[5?6]。適量飲酒有益于人體健康，降低心血管疾病的發生[7?9]、抑制動脈平滑肌收縮[10]、促進血液循環和抗癌[11]等功效。隨著發酵時間延長，果酒中的揮發性風味物質逐漸增多。香氣成分的測定是柚子全果果酒在釀造過程中的重要指標之一，可直接反映出果酒品質的好壞，并影響消費者的選購心理。頂空固相微萃取和氣質（Gas Chromatography Mass Spectrometer，GCMS）聯用技術是目前應用于發酵果酒揮發性風味物質測定分析的主要方法[12]。

目前果酒的品種逐漸增多，但柚子酒相關的研究相對較少，多數柚子的加工中是以柚子肉為原料，柚子皮被舍棄。柚子皮中含有多種功效成分如柚皮苷等，具有較高的營養價值[13]。柚子皮在加工過程中常常被丟棄，這會對環境造成巨大的污染。此外，國內外關于柚子全果果酒的抗氧化性和香氣成分鮮見報道。本研究以新鮮的柚子皮和瓤肉為原料，在單因素實驗的基礎上利用正交試驗對其發酵工藝進行優化并測定成品酒的體外抗氧化活性和香氣成分，為柚子酒工業化、規?；蜆藴驶a提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

福建琯溪蜜柚 購于廣州華潤超市；釀酒活性干酵母 購于安琪酵母旗艦店；1,1-二苯基-2-苦基肼基（DPPH）、氯化鈉、食用小蘇打、六水三氯化鐵、七水硫酸亞鐵、偏重亞硫酸鉀、無水乙醇、冰乙酸、果膠酶（500U/mg）、三吡啶基三嗪（TPTZ）、醋酸鈉、白砂糖、食鹽、檸檬酸（食品級）購于廣州碩瑪實驗室儀器有限公司；試劑均為分析純。

WYT-J手持糖度計 成都豪創光電儀器有限公司；DFG-02.300 電熱恒溫鼓風干燥箱 黃石市恒豐醫療器械有限公司；PHB-3pH便攜式pH計 上海三信儀表廠；HH-s4 數顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；WYA-2W阿貝折射儀 上海精密科學儀器有限公司；UV759 紫外可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；BSP-250 程控生化培養箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；6890-5973N氣相色譜質譜儀 美國Agilent科技有限公司；PDMS50 固相微萃取裝置 深圳市東方藍泰科技有限公司；57330-U萃取手柄 美國Supelco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 柚子果酒加工工藝流程及操作要點 新鮮柚子→清洗→切?！と馀浔冗x定→脫苦→打漿→酶解處理→滅酶→添加SO2→調糖調酸→接種→發酵→過濾→陳釀→成品

操作要點：

清洗、切粒：新鮮柚子洗凈后剝皮，去籽，取全肉，柚子皮削掉表面青皮留白皮，并將其切成1 cm3的顆粒，備用。

皮肉配比選定：選擇三個具有代表性的比例，分別是①肉:皮=1:1、②肉:皮=1:2、③肉:皮=2:1，按以上比例加入等比例的蒸餾水混合進行釀造。發酵7 d時測定酒精度，選出最合適的皮肉配比進行發酵工藝優化實驗。

脫苦：往柚子皮上撒5%食鹽，反復揉搓后擠去汁液，重復三次，用蒸餾水將柚子皮中的鹽分洗凈，擠干，備用。

打漿：原料與純凈水等比例混合（m:V=1:1），放入打漿機中打成糊狀，有利于下一步酶解[14]。

酶解與滅酶：往打漿后的原料中加入0.025%果膠酶，于40 ℃水浴鍋中酶解2 h，并在90～95 ℃下滅酶5 min。

添加SO2：將全果發酵液與80mg/L偏重亞硫酸鉀充分混合，攪拌均勻。

調糖：由于柚子全果含糖量不高，制得的原液含糖量較低（3%～4%），所以要根據酵母釀酒所需的糖度來進行發酵前的調配。向原液中加入精制白砂糖后充分攪拌使其完全溶解，使用手持糖度計測定其糖度，以確定是否達到發酵所需糖度?？偺呛坑嬎愎饺缦拢?/p>

式中，A為總糖質量分數（%），B為柚子汁的質量（g），C為糖的添加量（g），D為原柚子汁的含糖量（%）。

調pH：使用檸檬酸或小蘇打將柚子原液的pH控制在3.0～5.0 之間，達到最好的發酵條件。

酵母活化與接種：取10%的活性干酵母加入到含糖量為4%的溫水（34～40 ℃）中，混勻后靜置，攪拌20～30 min后直接加入柚子原液進行發酵。

確定發酵時間：取600 mL發酵液于錐形瓶中在20 ℃條件下進行發酵，每隔1 d測定一次酒精度，直到所測數據趨于穩定時，方可確定發酵時間。

過濾：發酵結束后用濾布濾去酒渣，再將濾液離心取得上清液。

陳釀：離心后得到的上清液進行低溫后發酵（15 ℃）。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 含糖量對柚子全果果酒酒精度的影響 取200 mL柚子原液在溫度20 ℃，含糖量分別為16%、18%、20%、22%、24%，偏重亞硫酸鉀120 mg/L，酵母菌接種量1.0%，初始pH4.0 的條件下進行釀制，發酵7 d時測定酒精度。

1.2.2.2 偏重亞硫酸鉀添加量對柚子全果果酒酒精度的影響 取200 mL柚子原液在溫度20 ℃，含糖量20%，偏重亞硫酸鉀分別為0、40、80、120、160 mg/L，酵母菌接種量1.0%，初始pH4.0 的條件下進行釀制，發酵7 d時測定酒精度。

1.2.2.3 酵母接種量對柚子全果果酒酒精度的影響 取200 mL柚子原液在溫度20 ℃，含糖量20%，偏重亞硫酸鉀120 mg/L，酵母菌接種量分別為0.4%、0.7%、1.0%、1.3%、1.6%，初始pH4.0 的條件下進行釀制，發酵7 d時測定酒精度。

1.2.2.4 初始pH對柚子全果果酒酒精度的影響 取200 mL柚子原液在溫度20 ℃，含糖量20%，偏重亞硫酸鉀120 mg/L，酵母菌接種量1.0%，初始pH分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 的條件下進行釀制，發酵7 d時測定酒精度。

1.2.3 正交試驗 在單因素實驗的基礎上，選取含糖量、偏重亞硫酸鉀添加量、酵母接種量和初始pH4 個因素，以酒精度為指標，進行正交試驗設計以確定柚子全果果酒的最佳發酵工藝。正交試驗因素水平如表1 所示。

表1 正交試驗因素水平設計Table 1 Orthogonal test factors level design

1.2.4 理化指標測定 乙醇體積分數的測定：酒精計；pH的測定：PHB-3pH便攜式pH計；可溶性固形物的測定：手持糖度計。

1.2.5 體外抗氧化活性測定

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力測定 參考Kilani等[15]的方法并稍作修改。柚子全果果酒是在含糖量22%，偏重亞硫酸鉀分別為40 mg/L，接種量1.0%，初始pH 4.0 的條件下制作的。取0.2 mL柚子全果果酒加入4 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液在常溫暗處反應30 min測517 nm的吸光度A1，從發酵第1～9 d每隔2 d測一次吸光度A1。以0.2 mL 50%乙醇代替樣品為對照，測517 nm的吸光度A2。以無水乙醇為空白。按式（1）計算DPPH·清除率：

1.2.5.2 鐵離子還原能力測定 參照Iris等[16]的方法并稍作修改。柚子全果果酒是在含糖量22%，偏重亞硫酸鉀分別為40 mg/L，接種量1.0%，初始pH 4.0 的條件下制作的。取2.5 mL TPTZ（10 mmol/L）、2.5 mL FeCl3·6H2O（20 mmol/L）和25 mL pH3.6 醋酸緩沖液（0.3 mol/L）充分混勻得到FRAP溶液，在37 ℃恒溫水浴鍋中貯藏備用。取3mL FRAP溶液加入3 mL超純水和0.1 mL柚子全果果酒充分混合后于37 ℃水浴鍋中避光放置5 min，以超純水代替柚子全果果酒為空白，從發酵第1～9 d每隔2 d測一次吸光度（593 nm）。以FeSO4·7H2O為標品制作標曲：y=0.0071x+0.0692（R2=0.9988），根據標曲計算硫酸亞鐵的濃度（mmol/L）。

1.2.6 香氣成分分析

1.2.6.1 香氣成分的富集 柚子全果果酒是在含糖量22%，偏重亞硫酸鉀分別為40 mg/L，接種量1.0%，初始pH 4.0 的條件下制作的。取7 mL柚子全果果酒和1 g NaCl于15 mL頂空瓶中，用萃取頭（57330-U）在40 ℃下吸附45 min，解析5 min，進行分析。

1.2.6.2 氣相色譜-質譜條件 色譜柱：HP-5MS色譜柱（19091S-413，30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣He；進樣口溫度250 ℃；程序升溫：35 ℃保持2 min，以5 ℃/min升至50 ℃，再以6 ℃/min升至110 ℃，最后以8 ℃/min升至230 ℃，保持5 min；柱流量0.8 mL/min；不分流進樣；質量掃描范圍50～550 amu；離子源溫度250 ℃；電離方式EI；電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 發酵時間的確定

由圖1 可知，隨著發酵時間延長，柚子全果果酒的酒精度先上升后趨于平緩，在第7 d達到了13%vol。在第7～9 d時，柚子全果果酒的酒精趨于平緩，可能是酵母菌在發酵過程中逐漸衰老，使得糖的轉化率逐步下降，導致果酒的酒精度增加漸緩。故可以確定柚子全果果酒的發酵時間為7 d。

圖1 柚子全果果酒在發酵過程中酒精度的變化Fig.1 Changes in alcohol content of grapefruit whole fruit wine during fermentation

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 含糖量對柚子全果果酒酒精度的影響 由圖2可知，隨著含糖量增加，柚子全果果酒的酒精度逐漸升高后趨于平緩，在20%時達到了13.4%vol，說明當含糖量偏高時，發酵液中酵母菌將部分糖醇化，使多余糖分無法被消耗變成酒精，導致果酒中殘留總糖過多，造成品質下降。此結果與于斌等[17]研究含糖量對沙果果酒發酵中酒精度變化的結果相似。因此，含糖量選擇為20%。

圖2 含糖量對柚子全果果酒酒精度的影響Fig.2 The effect of sugar content on the alcohol content of grapefruit whole fruit wine

2.2.2 偏重亞硫酸鉀添加量對柚子全果果酒酒精度的影響 果酒制作過程中添加偏重亞硫酸鉀能產生SO2，對果酒的抗氧化、澄清、增酸、護色和抑菌起著重要作用。由圖3 可知，隨著偏重亞硫酸鉀添加量的增加，柚子全果果酒的酒精度先升高后下降，在80 mg/L時達到了13.3%vol。當偏重亞硫酸鉀添加量為80～160 mg/L時，柚子全果果酒的酒精度有所下降，可能是添加偏重亞硫酸鉀后產生SO2過多不利于酵母菌利用糖類發酵生成酒精[5]。此結果與王婭玲等[18]研究SO2添加量對木奶果果酒發酵中酒精度變化的結果相似。因此，偏重亞硫酸鉀添加量選擇為80 mg/L。

圖3 偏重亞硫酸鉀對柚子全果果酒酒精度的影響Fig.3 Effect of potassium bisulfite on the alcohol content of grapefruit whole fruit wine

2.2.3 接種量對柚子全果果酒酒精度的影響 由圖4可知，隨著酵母接種量的增加，柚子全果果酒的酒精度先升高后下降，在1.0%時達到了14.2%vol。當接種量為1.0%～1.6%時，柚子全果果酒的酒精度有所下降，可能是接種量過多，大量微生物代謝會消耗部分糖分，造成發酵液中糖分不足，導致果酒中乙醇體積分數下降[19?20]；或代謝產物持續累積抑制了酵母菌的生長，加快酵母菌的衰老，造成果酒中酒精度下降[21?22]。此結果與王孝榮等[5]研究酵母接種量對草莓果酒發酵中酒精度變化的結果相似。因此，酵母接種量選擇為1.0%。

圖4 接種量對柚子全果果酒酒精度的影響Fig.4 Effect of inoculation amount on the alcohol content of grapefruit whole fruit wine

2.2.4 初始pH對柚子全果果酒酒精度的影響 由圖5 可知，隨著初始pH增加，柚子全果果酒的酒精度逐漸升高后趨于平緩，在4.5 時達到了14.2%vol。當初始pH為4.5～5.0 時，柚子全果果酒的酒精度趨于平緩，可能是酵母菌的最適pH在4.5～5.0 之間，酵母菌穩定生長，果酒中的糖被醇化，使果酒中的酒精度趨于穩定，有利于維持果酒的發酵和成品質量[23?24]。因此，初始pH選擇為4.5。

圖5 初始pH對柚子全果果酒酒精度的影響Fig.5 Effect of initial pH on the alcohol content of grapefruit whole fruit wine

2.3 正交試驗結果

以酒精度為指標，采用L9（34）正交試驗方法，確定柚子全果果酒的最佳發酵工藝。正交試驗設計及結果見表2。

表2 正交試驗設計及結果Table 2 Orthogonal test design and results

由表2 可知，影響柚子全果果酒發酵工藝的因素依次是A>D>B>C，即影響柚子全果果酒發酵工藝的因素依次為含糖量、初始pH、偏重亞硫酸鉀添加量、酵母接種量。由表3 可知，因素A為差異顯著因素（P<0.05），因素B、C、D為差異不顯著因素（P>0.05），此結果與直觀分析結果一致。最佳發酵工藝分別為A3B1C2D1和A3B2C2D1，即含糖量22%，偏重亞硫酸鉀添加量分別為40、80 mg/L，酵母接種量1.0%，pH4.0，在此條件下柚子全果果酒的酒精度分別為14.4%vol和14.2%vol。因此柚子全果果酒的最優發酵工藝為A3B1C2D1，對應柿子全果果酒酒精度為14.4%vol。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table

2.4 體外抗氧化活性分析

2.4.1 DPPH自由基清除能力分析 由圖6 可知，隨著發酵時間延長，柚子全果果酒中DPPH·清除能力逐漸下降后趨于平緩。發酵時間到第9 d時，DPPH·清除率下降了5.01%，發酵到第7 d時基本達到穩態。分析原因有以下三個方面：第一，活性酵母在發酵過程中產生次級代謝產物，同時其細胞壁吸附了果酒中的抗氧化物質[25]。第二，在微生物酶催化下，柚子細胞壁會分解生成蛋白質、糖苷等物質，使DPPH自由基清除率下降。第三，果酒發酵過程中的pH、溫度、酒精度等均可影響DPPH自由基清除率[26]，導致果酒在發酵過程中多酚和黃酮類化合物含量下降，使其抗氧化活性下降[27]。

圖6 柚子全果果酒DPPH·清除率的動力學反應Fig.6 Kinetic reaction of DPPH free radical scavenging rate from grapefruit wine

2.4.2 鐵離子還原能力分析 由圖7 可知，隨著發酵時間延長，柚子全果果酒中FRAP值逐漸下降后趨于平緩，在第1 d時達到了164.39 mmol Fe2+/L。分析原因可能是果酒中各種活性成分在發酵階段不斷被浸出，使其抗氧化活性較強。發酵時間到第9 d時，鐵離子還原能力下降了13.99 mmol Fe2+/L，發酵到第7 d時基本達到穩態。分析原因有以下三個方面：第一，果酒在過濾時與氧氣充分接觸，其抗氧化活性成分在發酵階段被氧化，造成鐵離子還原能力下降[28]；第二，單體酚和酚酸等抗氧化物質在發酵階段參與了果酒中尚未結束的生化反應，不斷合成、分解產生花色苷衍生物和結合態酚酸衍生物，使其抗氧化能力下降[29?30]；第三，果酒在密閉環境中進行發酵，氧氣幾乎完全消耗，使抗氧化能力趨于穩定。

圖7 柚子全果果酒鐵離子還原能力的動力學反應Fig.7 Kinetic reaction of iron reduction ability from grapefruit whole fruit wine

2.5 香氣成分分析

圖8 為柚子全果果酒香氣物質的GC-MS分析離子流色譜圖，各組分鑒定的結果如表4 所示。由表4 可知，采用頂空固相微萃取結合氣質聯用技術初步鑒定出柚子全果果酒的香氣物質有23 種。其中，相對含量>1%的香氣物質為：苯乙醇（22.54%）、醋酸（9.10%）、辛酸乙酯（8.90%）、3-甲基-1-丁醇乙酸酯（13.01%）、芳樟醇（8.83%）、癸酸乙酯（8.04%）、乙醇（3.21%）、9-溴壬酸乙酯（2.59%）、3-甲基丁醇（1.61%）、正己酸乙酯（20.29%）、乳酸乙酯（2.02%）、1-甲氧基-2-丁醇(1.25%)。康明麗等[31]研究柑橘果酒的揮發性風味物質，發現苯乙醇、辛酸乙酯、癸酸乙酯和正己酸乙酯等為果酒作出主要貢獻。苯乙醇為柚子果酒提供清甜的玫瑰花香，不僅能夠殺菌，還能用于制作香精香料[32]。大多數酯類物質具有花果香味或濃郁的酒香味，如辛酸乙酯、癸酸乙酯和正己酸乙酯分別為柚子果酒提供酒香味、椰子香和水果香[31]。

圖8 柚子全果果酒香氣物質的GC-MS分析離子流色譜圖Fig.8 GC-MS analysis ion chromatogram of aroma substances from grapefruit whole fruit wine

表4 柚子全果果酒中主要香氣成分Table 4 Main flavor compounds from grapefruit whole fruit wine

通過對柚子全果果酒的香氣成分分析，共鑒定出酯類化合物10 種，醇類化合物9 種、酸類化合物4 種。酯類的相對含量為58.36%；醇類的相對含量為40.69%；酸類的相對含量為11.38%。

3 結論

以瓤肉和柚子皮為原料釀制果酒，不僅能夠增加柚子的附加值，還能避免資源浪費問題。利用正交試驗對4 個因素進行優化分析，獲得最優發酵參數為：含糖量22%，偏重亞硫酸鉀添加量40 mg/L，酵母接種量1.0%，pH4.0，在此條件下柚子全果果酒的酒精度為14.4%vol。DPPH自由基清除率和鐵離子還原能力結果表明隨著發酵時間延長，柚子全果果酒的體外抗氧化能力逐漸下降。采用頂空固相微萃取結合GC-MS技術分析柚子全果果酒的香氣成分，初步鑒定出23 種香氣物質，其中酯類化合物的種類和相對含量分別占總香氣物質的43.48%和58.36%。