超聲輔助酶法提取無(wú)籽刺梨果渣中黃酮的工藝優(yōu)化及其抗氧化活性

楊宗玲，李 晗，范方宇，郭 磊，王振興，楊代勇，何曉雪，林仫發(fā)

（1.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明 650224；3.云南省昆明市生產(chǎn)力促進(jìn)中心，云南昆明 650224）

無(wú)籽刺梨（Rosa sterilisS.D.Shi）屬薔薇科薔薇屬多年生落葉攀緣類果樹(shù)，廣泛分布于亞熱帶及暖溫帶地區(qū)，我國(guó)主要分布在四川、貴州、云南等地，其成熟后表面果刺脫落，種子敗育，無(wú)果核或少許果核，故名無(wú)籽刺梨[1?4]。近年來(lái)，隨著刺梨產(chǎn)業(yè)越來(lái)越受國(guó)家和地方的重視，以貴州省為主的刺梨產(chǎn)量也逐年提高。目前，刺梨加工類食品主要有果脯、果酒、果醬、飲料、果奶、刺梨糕等。隨大量刺梨加工產(chǎn)品出現(xiàn)，其加工副產(chǎn)物—刺梨果渣也逐年上升。刺梨果渣約占果實(shí)質(zhì)量的50%[5]。初步估計(jì)僅貴州省每年產(chǎn)刺梨果渣達(dá)7500 噸以上[6]。為減少資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。刺梨果渣深加工的相關(guān)研究也相繼出現(xiàn)，如以刺梨果渣為原料提取膳食纖維[7]、多糖[8]、制備刺梨果渣超微粉[9]、發(fā)酵果醋[10]、生產(chǎn)飼料[11]等。

無(wú)籽刺梨果渣富含多種活性成分如超氧化物歧化酶、多酚、多糖、胡蘿卜素、三萜、苷類、維生素C、黃酮類化合物，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗癌、抗疲勞及延緩衰老等作用[12?14]。據(jù)報(bào)道，刺梨經(jīng)榨汁后80%以上的黃酮留在刺梨渣中[11]。王振偉等[15]利用超聲波輔助提取刺梨中黃酮，結(jié)果表明，超聲波輔助提取刺梨黃酮較常規(guī)回流提取法，黃酮得率被有效提高；李俠等[16]以綠豆皮為原料，比較了單獨(dú)超聲提取和酶法提取綠豆皮中總黃酮，結(jié)果表明，在相同超聲條件下，超聲波-酶法提取綠豆皮中黃酮類化合物得率提高了18.54%。采用超聲輔助酶法提取無(wú)籽刺梨中黃酮的研究鮮有報(bào)道。本文采用超聲輔助酶法提取無(wú)籽刺梨果渣中黃酮并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行研究，以期為無(wú)籽刺梨中黃酮的進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

無(wú)籽刺梨果渣 云南曲靖昆鋼金副食品有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 HPLC≥98%，上海源葉生物科技公司；鹽酸 分析純，云南楊林工業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)汕滇藥業(yè)有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）純度≥99.5%，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；亞硝酸鈉、無(wú)水乙醇、硝酸鋁、抗壞血酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、鐵氰化鉀、水楊酸、過(guò)氧化氫 分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；纖維素酶（CAS 9012-54-8） 酶活力≥35U/mg（BR級(jí)別），南京都南生物公司；DPPH（96%）、三氯乙酸、三氯化鐵、鄰苯三酚 分析純，上海麥克林生化科技有限公布公司；七水合硫酸亞鐵 分析純，廣東光華科技股份有限公司。

DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；BJ-800A粉碎機(jī) 永康市鉑歐五金制品有限公司；DT-1 電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器公司；DK-98-2 恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；SB25-12DTDS超聲波清洗機(jī) 寧波新藝超聲設(shè)備有限公司；UV-2600 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)日本島津公司；Sigma3K15 離心機(jī) 德國(guó)西格瑪離心機(jī)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 無(wú)籽刺梨果渣中總黃酮提取研究

1.2.1.1 無(wú)籽刺梨果渣處理 采用60 ℃烘箱干燥無(wú)籽刺梨果渣24 h，粉碎，過(guò)60 目篩，儲(chǔ)存于4 ℃冰箱中備用。

1.2.1.2 無(wú)籽刺梨果渣中黃酮提取工藝 準(zhǔn)確稱量2.00 g無(wú)籽刺梨果渣粉，按設(shè)定液料比加入所需濃度的乙醇，用1 mol/L NaOH和10%醋酸調(diào)節(jié)pH為4.5（纖維素酶酶解適宜pH），設(shè)置超聲參數(shù)（超聲溫度為60 ℃）進(jìn)行超聲提取，超聲提取結(jié)束后，按底物濃度加入設(shè)定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的纖維素酶，于水浴鍋中50 ℃水浴酶解，酶解結(jié)束后，于90～95 ℃水浴滅酶5 min，5500 r/min于離心機(jī)中離心10 min。取上清液用相應(yīng)提取濃度的溶劑于容量瓶中定容至100 mL得黃酮粗提取液。

1.2.1.3 黃酮含量測(cè)定 參考劉暢等[17]的方法，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸直線方程為y=12.962x?0.014，R2=0.99924。取1 mL1.2.1.2 中制備的黃酮粗提液于25 mL的容量瓶中，用相應(yīng)提取濃度的乙醇定容使其稀釋25 倍，再于稀釋液中取1 mL于10 mL容量瓶中。按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法加入相應(yīng)試劑顯色后于510 nm處測(cè)定吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算黃酮濃度，采用式（1）計(jì)算黃酮得率。

式中：10 為1 mL稀釋液加試劑顯色后的總體積，mL；C為1 mL稀釋液加試劑顯色后溶液中黃酮的濃度，mg/mL；n為稀釋倍數(shù)，25；100 為黃酮粗提液體積，mL；m為無(wú)籽刺梨果渣粉質(zhì)量，g。

1.2.1.4 無(wú)籽刺梨果渣黃酮提取單因素實(shí)驗(yàn) 以液料比30 mL/g、乙醇濃度60%、超聲時(shí)間40 min、超聲功率250 W、酶解時(shí)間40 min、加酶量0.2%為基本條件，改變液料比（10、20、30、40、50 mL/g）、乙醇濃度（30%、40%、50%、60%、70%、80%）、超聲時(shí)間（30、40、50、60、70 min）、超聲功率（150、200、250、300、350 W）、酶解時(shí)間（20、30、40、50、60 min）、加酶量（0.0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）六個(gè)因素條件，考察各個(gè)因素對(duì)超聲輔助酶法提取無(wú)籽刺梨果渣中黃酮得率的影響。

1.2.1.5 無(wú)籽刺梨果渣黃酮提取響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取影響超聲輔助酶法提取無(wú)籽刺梨果渣中黃酮得率的主要因素液料比、乙醇濃度、超聲時(shí)間和加酶量作為自變量，無(wú)籽刺梨果渣中黃酮得率為響應(yīng)值，利用軟件Design-Expert.V8.0.6.1中Box-Behnken試驗(yàn)原理，設(shè)計(jì)四因素三水平的優(yōu)化試驗(yàn)。因素及水平編碼如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.2 無(wú)籽刺梨果渣黃酮純度計(jì)算 將優(yōu)化工藝條件下制備的無(wú)籽刺梨果渣黃酮粗提液使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至浸膏，冷凍干燥，稱取4.40 mg黃酮粗提物，用55%乙醇溶解并定容至25 mL作為待測(cè)液，取1 mL待測(cè)樣液按1.2.1.3 中的方法計(jì)算待測(cè)液中的黃酮含量。黃酮純度采用式（2）計(jì)算。本研究提取無(wú)籽刺梨果渣黃酮純度為25.5%。

式中M1為待測(cè)樣液中黃酮含量，mg；M2為黃酮粗提物質(zhì)量，mg。

1.2.3 無(wú)籽刺梨果渣中黃酮抗氧化活性研究 無(wú)籽刺梨果渣中黃酮抗氧化活性強(qiáng)弱以樣品清除率為50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度（EC50，mg/mL）來(lái)判斷，EC50值越低表示抗氧化性越強(qiáng)。EC50采用Origin 8.0 回歸分析計(jì)算。

1.2.3.1 DPPH·清除率測(cè)定 參照譚欽鐸[18]的方法，將1.2.1 部分中超聲輔助酶法提取無(wú)籽刺梨果渣中黃酮優(yōu)化工藝參數(shù)為提取條件提取黃酮，所得黃酮粗提液使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至浸膏，然后冷凍干燥。凍干粉采用55%的乙醇復(fù)溶，配制黃酮濃度為0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.08、0.1 mg/mL，取2 mL不同質(zhì)量濃度的樣品液于試管中加入0.08 mg/mL的DPPH溶液，采用漩渦震蕩儀混勻，避光反應(yīng)30 min后，測(cè)定在517 nm處樣品的吸光度值（A0）；取2 mL不同濃度的樣品液于試管中，加入2 mL無(wú)水乙醇作為對(duì)照組，測(cè)定在517 nm處的吸光度值（A1）；以2 mL無(wú)水乙醇和2 mL DPPH溶液反應(yīng)設(shè)置空白組，測(cè)定在517 nm處的吸光度值（A2）。以同濃度的VC為對(duì)照。DPPH·清除率采用式（3）計(jì)算。

抗逆力(resilience，又被翻譯為“復(fù)原力”、“心理韌性”等)是個(gè)人面對(duì)生活逆境時(shí)，能夠理性做出正向的、建設(shè)性的選擇方法和應(yīng)對(duì)策略的能力③。抗逆力是20 世紀(jì)50 年代以來(lái)歐美各國(guó)心理學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)問(wèn)題。抗逆力理論主張從積極心理學(xué)視角挖掘個(gè)人的內(nèi)在潛能，不再單純關(guān)注問(wèn)題的負(fù)面影響，而是強(qiáng)調(diào)人在面對(duì)壓力、逆境時(shí)的潛能激發(fā)和自我超越④。

1.2.3.2 ·OH清除率測(cè)定 參考張倩茹[19]的方法，配制無(wú)籽刺梨果渣黃酮濃度為分別0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4、0.8、1.2、1.6 mg/mL，于試管中依次加入1.0 mL樣液、1.0 mLFeSO4（9.0 mol/L）、1.0 mLH2O2（8.8 mmol/L），采用漩渦震蕩儀混勻，室溫反應(yīng)10 min，再加入1.0 mL水楊酸乙醇溶液（9.0 mmol/L），室溫靜置反應(yīng)30 min，5000 r/min于離心機(jī)中離心5 min，取上清液測(cè)定510 nm處吸光度值為A0。取相同濃度的VC為對(duì)照。·OH清除率采用式（4）計(jì)算。

式中：A1為蒸餾水代替FeSO4吸光度值；A2為55%乙醇代替樣液吸光度值。

式中：A0為樣液和鄰苯三酚的吸光度值；A1為不加鄰苯三酚添加樣品的吸光度值；A2為添加鄰苯三酚不加樣品的吸光值。

1.2.3.4 還原力測(cè)定 參照孟娜等[21]的方法，利用鐵氰化鉀還原法，樣品還原力的強(qiáng)弱通過(guò)測(cè)定吸光度值判斷，吸光度值越大，還原力越強(qiáng)。具體方法為：配制無(wú)籽刺梨果渣黃酮濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL，于試管中依次加入2.5 mL樣液、2.5 mL磷酸緩沖溶液（0.2 mol/L，pH6.6）、2.5 mL1%鐵氰化鉀水溶液，50 ℃水浴20 min，取出后迅速冷卻，加入10%三氯乙酸水溶液2.5 mL，離心（3000 r/min，10 min），依次取5.0 mL上清液、4.0 mL蒸餾水、1.0 mL0.1%三氯化鐵水溶液混合均勻，測(cè)定700 nm處吸光度值。取相同濃度的VC為對(duì)照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以上處理均做3 次平行實(shí)驗(yàn)，圖表中數(shù)據(jù)為3 次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值。利用軟件Design-Expert.V8.0.6.1 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，軟件IBM SPSS Statistics 20 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，軟件Origin 8.0 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 液料比對(duì)無(wú)籽刺梨果渣黃酮提取的影響 由圖1 可知，在液料比10～30 mL/g范圍內(nèi)，黃酮得率隨液料比增大呈顯著（P<0.05）上升趨勢(shì)；液料比40 mL/g時(shí)，黃酮得率達(dá)到最大值，為83.45 mg/g；繼續(xù)提高液料比黃酮得率差異不顯著（P>0.05）。原因?yàn)橐毫媳冗^(guò)低，原料與提取溶劑接觸不充分，黃酮未被有效溶出；增大液料比，原料被充分浸沒(méi)在提取溶劑中，在超聲波作用下黃酮被充分溶出，得率提高；液料比過(guò)大時(shí)，體系中的可溶性物質(zhì)會(huì)與黃酮競(jìng)爭(zhēng)溶劑，影響黃酮提取，另外，過(guò)高的液料比會(huì)使超聲波的能量過(guò)多消耗在溶劑上，而原料吸收的能量較低，黃酮得率下降[22]。本文選擇液料比水平30、40、50 mL/g進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖1 液料比對(duì)黃酮提取的影響Fig.1 Effect of liquid-material radio on the extraction of flavonoids

2.1.2 乙醇濃度對(duì)無(wú)籽刺梨果渣黃酮提取的影響 由圖2 可知，在乙醇濃度30%～60%范圍內(nèi)，黃酮得率隨乙醇濃度升高逐漸增加，黃酮得率在乙醇濃度60%時(shí)達(dá)到最大，為83.45 mg/g，繼續(xù)增大乙醇濃度，黃酮得率呈顯著（P<0.05）下降趨勢(shì)。主要原因?yàn)橐掖紳舛鹊母叩椭苯佑绊懠?xì)胞內(nèi)外的濃度差，濃度差越大越有利于黃酮浸出，黃酮得率提高[22]；但乙醇濃度過(guò)高時(shí)，體系中一些脂溶性物質(zhì)增多與黃酮競(jìng)爭(zhēng)性地浸出，另外，乙醇濃度過(guò)高會(huì)使纖維素酶活性降低，導(dǎo)致黃酮得率下降[23]。本文選乙醇濃度50%、60%、70%進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖2 乙醇濃度對(duì)黃酮提取的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction of flavonoids

圖3 超聲時(shí)間對(duì)黃酮提取的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on extraction of flavonoids

2.1.4 超聲功率對(duì)無(wú)籽刺梨果渣黃酮提取的影響圖4 可知，在150～300 W的超聲功率范圍內(nèi)，隨超聲功率的增大，黃酮得率逐漸增加，超聲功率300 W時(shí)黃酮得率達(dá)到最大，為83.77 mg/g；當(dāng)超聲功率大于300 W時(shí)，黃酮得率顯著（P<0.05）降低。原因?yàn)槌暪β瘦^弱產(chǎn)生的機(jī)械及空化效應(yīng)對(duì)細(xì)胞壁的破壞程度小，黃酮得率低；而較強(qiáng)的超聲功率產(chǎn)生的空化效應(yīng)和機(jī)械波動(dòng)效應(yīng)可增強(qiáng)細(xì)胞壁破壞的作用，提高黃酮得率；功率過(guò)大，超聲熱效應(yīng)產(chǎn)生大量熱量使活性成分結(jié)構(gòu)破壞，也有學(xué)者認(rèn)為較高的超聲功率產(chǎn)生強(qiáng)大的機(jī)械振動(dòng)作用，使提取劑流動(dòng)加快導(dǎo)致超聲波的停留時(shí)間減小，同時(shí)空化作用增強(qiáng)后產(chǎn)生的大量無(wú)用空化泡會(huì)增加超聲波的散射衰減，得率降低[26]。因此，超聲功率選擇300 W為宜。

圖4 超聲功率對(duì)黃酮提取的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on extraction of flavonoids

2.1.5 酶解時(shí)間對(duì)無(wú)籽刺梨果渣黃酮提取的影響 由圖5 可知，黃酮得率在酶解時(shí)間20～40 min內(nèi)隨酶解時(shí)間的增大逐漸增大，40 min時(shí)達(dá)到最大值，為81.84 mg/g；當(dāng)酶解時(shí)間超過(guò)40 min，黃酮得率顯著（P<0.05）下降。原因?yàn)槊附鈺r(shí)間過(guò)短，纖維素酶對(duì)細(xì)胞壁的破碎不完全，黃酮未被有效提取；隨酶解時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞壁被充分破碎，黃酮被有效釋放，黃酮得率增加；酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，底物濃度不斷降低或產(chǎn)物的積累對(duì)酶的活性有反饋抑制作用，酶促反應(yīng)降低，黃酮得率降低[27]。因此，酶解時(shí)間選擇40 min為宜。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)黃酮提取的影響Fig.5 Effect of enzymolysis time on extraction of flavonoids

2.1.6 加酶量對(duì)無(wú)籽刺梨果渣黃酮提取的影響 由圖6 可知，在加酶量0.0%～0.2%范圍，隨著加酶量的增加，黃酮得率逐漸增加，0.2%時(shí)黃酮得率最大，為84.09 mg/g，當(dāng)加酶量大于0.2%，黃酮得率隨加酶量的增加顯著（P<0.05）減少。原因?yàn)樘砑永w維素酶可將纖維素水解成水溶性糖，使細(xì)胞壁水解破裂增加細(xì)胞通透性，促進(jìn)黃酮向主體溶劑中擴(kuò)散，提高黃酮得率[26]。然而，過(guò)量的酶添加量會(huì)使大量的酶附著在無(wú)籽刺梨果渣粉表面，堵塞黃酮的溶出通道，影響黃酮化合物的溶出，黃酮得率降低[28]。因此，選擇加酶量0.1%、0.2%、0.3%三個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖6 加酶量對(duì)黃酮提取的影響Fig.6 Effect of enzyme dosage on extraction of flavonoids

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果及回歸模型方差分析 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇因素液料比（A）、乙醇濃度（B）、超聲時(shí)間（C）、加酶量（D）為考察對(duì)象，無(wú)籽刺梨果渣粉中黃酮得率（Y）為響應(yīng)值，采用軟件Design-Expert.V8.0.6.1 對(duì)無(wú)籽刺梨果渣粉中黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，表2 為響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果。通過(guò)回歸擬合得液料比、乙醇濃度、超聲時(shí)間和加酶量分析模型的二次多元回歸方程為：

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Test design and result of response surface methodology

Y=86.28+2.38A?4.37B?0.27C+1.97D?0.38AB?2.33AC?3.75AD?0.38BC?0.59BD?6.41CD?5.67A2?4.80B2?4.82C2?6.36D2

表3 為對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析的結(jié)果。由表3可知，模型中F=17.84，P<0.0001，模型差異極顯著，方程與實(shí)際情況擬合良好，能反應(yīng)黃酮得率與各因素之間的關(guān)系。失擬項(xiàng)F=1.79，失擬項(xiàng)差異不顯著（P=0.2702>0.05），表明模型與試驗(yàn)因素?cái)M合較好，可用該模型和方程優(yōu)化無(wú)籽刺梨中黃酮的提取工藝。決定系數(shù)R2為0.9434，在響應(yīng)面方差分析中，該值越大，表明實(shí)際值與模型預(yù)測(cè)值之間的相關(guān)性越高。各因素對(duì)黃酮得率的影響可用F值判斷，F(xiàn)值越大，影響作用越強(qiáng)[29?30]。模型結(jié)果表明，因素液料比、乙醇濃度和加酶量對(duì)無(wú)籽刺梨果渣中黃酮得率影響均顯著（P<0.05），影響無(wú)籽刺梨果渣中黃酮提取的因素順序?yàn)椋阂掖紳舛?液料比>加酶量>超聲時(shí)間。交互因素AD、CD以及二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2均顯著（P<0.05）。變異系數(shù)（C.V.）值越小，試驗(yàn)可靠性越高，本試驗(yàn)中C.V.=2.85%，表明試驗(yàn)結(jié)果可靠。精密度=12.907>4，表明試驗(yàn)可靠。

表3 響應(yīng)面二次模型方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface quadratic model

2.2.2 因素交互作用 響應(yīng)面圖形是通過(guò)Box-Behnken試驗(yàn)得到的多元二次回歸模型所作三維空間（3D）的曲面圖。在其他試驗(yàn)因素固定不變情況下，考察交互項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值的影響，其可直觀反應(yīng)因素間的交互作用。各因素對(duì)無(wú)籽刺梨果渣中黃酮得率影響的大小可通過(guò)響應(yīng)面3D圖曲面圖陡峭程度判斷，曲面越陡峭，影響越大，反之則越小。圖7 為各因素交互作用對(duì)黃酮得率影響的3D圖曲面圖，交互作用項(xiàng)液料比和加酶量與交互作用項(xiàng)加酶量和超聲時(shí)間的3D圖曲面較其它交互作用項(xiàng)更陡峭，表明兩組交互作用項(xiàng)對(duì)無(wú)籽刺梨果渣中黃酮得率的影響均顯著，這與表3 方差分析中回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果一致。根據(jù)表3 的分析結(jié)果，各交互因素對(duì)無(wú)籽刺梨果渣中黃酮得率影響程度排序?yàn)椋篊D>AD>AC>BD>AB=BC。研究建立的模型具有最大值，根據(jù)模型擬合的結(jié)果，酶-超聲提取無(wú)籽刺梨果渣中黃酮較優(yōu)提取工藝為液料比42 mL/g、乙醇濃度55%、超聲時(shí)間48 min、加酶量0.2%，在此條件下黃酮的得率預(yù)測(cè)值為87.78 mg/g。為驗(yàn)證響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果是否可靠，根據(jù)得到的優(yōu)化條件選擇液料比42 mL/g、乙醇濃度55%、超聲時(shí)間48 min、加酶量0.2%提取無(wú)籽刺梨果渣中的黃酮，進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，提取黃酮得率為87.52 mg/g，此結(jié)果與模型預(yù)測(cè)值相差0.26 mg/g，模型重復(fù)性較好，基于響應(yīng)面試驗(yàn)所得優(yōu)化工藝參數(shù)具有可靠性。

圖7 各因素交互作用對(duì)黃酮得率影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Surface graph of the effect of interaction on the yield of flavonoids

2.3 無(wú)籽刺梨果渣中黃酮抗氧化活性

2.3.1 清除DPPH·能力 圖8 為無(wú)籽刺梨果渣黃酮和VC對(duì)DPPH·清除率，由圖8 可知，在濃度0.005～0.02 mg/mL范圍內(nèi)，VC對(duì)DPPH·清除率隨濃度升高顯著（P<0.05）上升（43%～96%），當(dāng)VC濃度大于0.02 mg/mL后，VC對(duì)DPPH·的清除率維持在95%～96%，各濃度間清除率無(wú)顯著差異（P>0.05）。VC對(duì)DPPH·清除率EC50值為0.00628 mg/mL；在濃度0.005～0.05 mg/mL范圍內(nèi)，無(wú)籽刺梨果渣黃酮對(duì)DPPH·清除率顯著（P<0.05）上升（18%～92%），當(dāng)濃度大于0.05 mg/mL，黃酮對(duì)DPPH·的清除率為93%～94%，各濃度間清除率無(wú)顯著差異（P>0.05），其對(duì)DPPH·的EC50值為0.0139 mg/mL，該值小于10 mg/mL，表明無(wú)籽刺梨果渣中黃酮有較好的抗氧化活性。周藝等[31]研究刺梨茶中總黃酮對(duì)DPPH·清除率EC50為0.01227 mg/mL，結(jié)合本試驗(yàn)，刺梨果渣中黃酮對(duì)DPPH·清除率略低于刺梨茶中黃酮，原因?yàn)樵诖汤娼?jīng)加工成果渣過(guò)程，活性物質(zhì)受不同程度損傷，抗氧化活性降低。

2.3.2 清除·OH能力 ·OH是對(duì)生物體危害最大的一種自由基，能使蛋白質(zhì)、核酸、糖類等物質(zhì)發(fā)化生氧化和損傷，導(dǎo)致細(xì)胞壞死或突變，與衰老、腫瘤和細(xì)胞吞噬等作用有密切聯(lián)系[32]。圖9 為無(wú)籽刺梨果渣黃酮和VC對(duì)·OH清除率，由圖9 可知，隨濃度增加，黃酮粗提物和VC對(duì)·OH清除率均呈顯著（P<0.05）上升趨勢(shì)，在濃度0.05～0.4 mg/mL范圍內(nèi)，無(wú)籽刺梨果渣黃酮對(duì)·OH的清除率高于VC；在濃度0.8～1.6 mg/mL范圍內(nèi)，無(wú)籽刺梨果渣黃酮對(duì)·OH的清除能力略低于VC。無(wú)籽刺梨果渣黃酮對(duì)·OH清除率的EC50值為0.30788 mg/mL，VC對(duì)·OH清除率的EC50值為0.32076 mg/mL，根據(jù)EC50，無(wú)籽刺梨果渣黃酮對(duì)·OH的清除率略高于VC。

圖10 無(wú)籽刺梨果渣黃酮和VC對(duì)清除率Fig.10 Scavenging effect of flavonoids from Rosa sterilis pomace and VC on

2.3.4 還原力 具有還原力的物質(zhì)能夠?qū)e3＋還原為Fe2＋，F(xiàn)e2＋再與三氯化鐵反應(yīng)生成普魯士藍(lán)，生成物在700 nm波長(zhǎng)處有最大吸光度，因而700 nm波長(zhǎng)處吸光度大小反映了總還原力的強(qiáng)弱，吸光度越大，則樣品還原力越強(qiáng)[32,34]。圖11 為無(wú)籽刺梨果渣黃酮粗和VC的還原力能力，由圖11 可知，無(wú)籽刺梨果渣黃酮和VC的還原力隨濃度增大顯著（P<0.05）增強(qiáng)。在濃度0.02～0.06 mg/mL范圍內(nèi)，無(wú)籽刺梨果渣黃酮的還原力與VC相當(dāng)，在濃度為0.06 mg/mL時(shí)，無(wú)籽刺梨果渣黃酮和VC對(duì)應(yīng)的吸光度分別為0.77±0.01、0.73±0.04。隨著濃度升高，無(wú)籽刺梨果渣黃酮的還原能力不及VC，且VC還原力隨濃度的升高顯著（P<0.05）下降，原因可能為濃度0.3 mg/mL時(shí)，反應(yīng)體系中Fe3＋被全部還原，繼續(xù)增大VC濃度，過(guò)量的VC影響了生成物普魯士藍(lán)的顏色，導(dǎo)致吸光度下降。

圖11 無(wú)籽刺梨果渣黃酮和VC的還原力Fig.11 Reducing power of flavonoids from Rosa sterilis pomace and VC

3 結(jié)論

本文對(duì)酶-超聲提取無(wú)籽刺梨果渣中黃酮影響因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)分析，采用Box-Behnken法優(yōu)化無(wú)籽刺梨果渣中黃酮的提取工藝，得到最佳工藝參數(shù)：液料比42 mL/g、乙醇濃度55%、超聲時(shí)間48 min、超聲功率300 W、酶解時(shí)間40 min、加酶量0.2%。超聲輔助酶法提取無(wú)籽刺梨果渣中黃酮得率達(dá)到87.52 mg/g，回歸模型的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值（87.78 mg/g）接近，模型可靠。抗氧化實(shí)驗(yàn)表明，無(wú)籽刺梨果渣中黃酮對(duì)DPPH·、·OH、均具有一定的清除能力，其對(duì)DPPH·、·OH、的EC50值分別為0.0139、0.30788、0.94291 mg/mL，還原力實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低濃度下（0.02～0.06 mg/mL）的還原力與VC相當(dāng)，濃度0.2～0.5 mg/mL范圍內(nèi)，其還原力不及VC，無(wú)籽刺梨果渣中黃酮可作為天然食品抗氧化劑應(yīng)用。