采用Box-Behnken設計優化玫瑰花酵素發酵工藝及其抗氧化活性的測定

夏國燈，嚴 成, ，李林柯，李 坪，段旻燕，吳映川

（1.西南科技大學生命科學與工程學院，四川綿陽 621010；2.麗江程玫生物科技有限公司，云南麗江 674100；3.麗江程海沁香玫瑰莊園有限公司，云南麗江 674100）

酵素是以動植物、菌類等為原料，利用現代發酵技術發酵得到的含有特定生物活性成分的產品，其主要成分為酶、菌催化類以及抗氧化活性物質。其具有抗氧化[1]、促進新陳代謝、解酒護肝、預防心血管疾病[2]、抗糖尿[3]、預防衰老以及神經退行疾病[4]等功能。酵素是一種很特殊的復雜性蛋白質，在人體內擔任新陳代謝各種化學變化最重要的媒介體[5]。酵素存在于所有活細胞中，它啟動了細胞的活力，使細胞展現出種種生命現象。但人體自身只能制造補充部分酵素，其余大部分需要依靠食物不斷補充，近些年來，隨著食用酵素產品被越來越多的被人們認知，各種食用酵素產品層出不窮。但目前關于酵素的研究以及在市場上出現的酵素產品，以果蔬為原料制作的為主，很少有關于花卉酵素的研究。

玫瑰，又被稱為刺玫花、穿心玫瑰、徘徊花、赤薔薇等，是世界名花之一，屬薔薇科植物[6]。我國是玫瑰花的故鄉，玫瑰花在我國的發展歷史悠久，廣泛分布于北京、山東、甘肅、云南、四川等地，是我國重要特產經濟植物[7?8]。玫瑰花中含有豐富的花色苷、黃酮、多酚、多糖等活性物質，具有排毒養顏、行氣活血、抗氧化、抗菌、抗病毒、利膽解毒之功效[9]。目前，我國的玫瑰花主要應用于精油的提取[10?12]、玫瑰花醬的制作、玫瑰花餅干的制作、玫瑰花茶的制作等。在目前已有玫瑰花酵素的工藝研究中，大多以酵母菌復合其他菌種為發酵菌種，多以SOD酶活力為單一指標進行優化，且多以專利形式出現[13?14]。針對玫瑰花酵素科學性、系統性的研究以論文形式的鮮有報道。

本試驗以玫瑰花為原材料，應用現代微生物發酵技術，選用乳酸菌對玫瑰花進行發酵，研制出玫瑰花酵素，促進玫瑰花深加工產品發展，豐富我國酵素的市場，為工業化生產提供一些數據支持和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玫瑰花（法國墨紅）云南麗江程玫生物技術有限公司；安琪牌果蔬酵素發酵劑（麥芽糊精、植物乳桿菌N13、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、瑞士乳桿菌（Lactobacillushelveticus）、腸膜明串珠菌膜亞種（L.mesenteroidessub sp.mesenteroides）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus））湖北安琪酵母股份有限公司；白糖、乳糖 食品級市售；沒食子酸標準品、抗壞血酸、2,4,6-三（2-吡啶基）三嗪（TPTZ2,4,6-tris（2-pyridyl）-s-triazine）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical）、蘆丁標準品 均為色譜純，上海源葉生物科技有限公司；2,2-聯氮基-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨鹽（ABTS，2,2’-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）、福林酚、碳酸鈉、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁、鄰苯三酚、鹽酸、乙二胺四乙酸二鈉、過硫酸鉀 均為分析純，購于阿拉丁。

HH-8 型數顯恒溫水浴鍋 常州市金壇華特實驗儀器有限公司；UV 5800PC型紫外分光光度計 上海元析儀器有限公司；PH-030 型干燥/培二用箱上海齊欣科學儀器有限公司；THZ-82A型數顯氣浴恒溫振蕩器 常州普天儀器制造有限公司；UV1901型紫外可見分光光度計 四川億科實驗設備有限公司；臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；PHS-25 型pH計 上海越平科學儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 操作要點

1.2.2.1 玫瑰花預處理 將玫瑰花用無菌水沖洗干凈后，晾干水分，用沸水燙漂2 min后，取出晾干水分。

1.2.2.2 玫瑰花發酵基質制備及發酵 分別稱取預處理過的玫瑰花14 g、白糖17.8 g、乳糖4 g、量取無菌水150 mL到滅菌發酵罐，采用食品級碳酸鈣調整發酵基質pH 5.4，密封。發酵基質放入80 ℃水浴鍋中，密封后巴氏殺菌30 min。在發酵基質溫度降到33 ℃條件下接種1 g發酵劑到玫瑰花發酵基質中發酵72 h。待發酵結束后濾除玫瑰花花瓣，即得玫瑰花酵素液。

1.2.3 單因素實驗 主要選擇發酵溫度、發酵時間、接種量、初始pH四個工藝參數進行單因素實驗，具體方法如下：

1.2.3.1 發酵溫度的確定 玫瑰花14 g，乳糖4 g，白糖17.80 g，無菌水150 mL，接種量為1 g，初始pH 4.4，分別在27、30、33、36、39 ℃條件下發酵72 h。研究其對玫瑰花酵素液中SOD酶活力以及多酚含量的影響。

1.2.3.2 發酵時間的確定 玫瑰花14 g，乳糖4 g，白糖17.80 g，無菌水150 mL，接種量為1 g，初始pH 4.4，發酵溫度33 ℃，分別發酵24、48、72、96、120 h。研究其對玫瑰花酵素液中SOD酶活力以及多酚含量的影響。

1.2.3.3 接種量的確定 玫瑰花14 g，乳糖4 g，白糖17.8 g，無菌水150 mL，初始pH 4.4，發酵溫度33 ℃，接種量分別為0.4、0.7、1、1.3、1.6 g發酵72 h。研究其對玫瑰花酵素液中SOD酶活力以及多酚含量的影響。

1.2.3.4 初始pH的確定 玫瑰花14 g，乳糖4 g，白糖17.80 g，無菌水150 mL，接種量為1 g，發酵溫度33 ℃，分別在初始pH為2.4、3.4、4.4、5.4、6.4條件下發酵72 h。研究其對玫瑰花酵素液中SOD酶活力以及多酚含量的影響。

1.2.4 響應面優化 根據單因素實驗結果，對玫瑰花酵素發酵時間、發酵溫度、接種量、初始pH這4 個因素進行四因素三水平Box-Benhnken Design試驗，以玫瑰花酵素SOD酶活力以及多酚含量的綜合評分（綜合評分=（SOD酶活力+總酚含量分值）／2，其中SOD酶活力最大為100 分，按線性分配相應分值；多酚含量最大值為100 分，按線性分配相應分值）為響應值，以得到玫瑰花酵素的最佳發酵工藝，響應面試驗各因素水平如表1 所示。

表1 Box-Behnken實驗因素和水平設計Table 1 Factors and level of Box-Behnken experiment design

1.2.5 指標測定

1.2.5.1 SOD酶活力的測定 參考國家標準GB/T 5009.171-2003。

1.2.5.2 總酚含量的測定 參照文獻[15]的方法略作改動，測定總酚含量。準確移取25 μL樣品于50 mL比色管中，加入25 mL蒸餾水和2.5 mL福林酚，搖勻靜置3 min后加入飽和碳酸鈉溶液10 mL，用蒸餾水定容，靜置30 min。于765 nm波長處測定吸光度，以沒食子酸質量濃度對吸光度作標準曲線。得到回歸方程：Y=68.714X+0.011（X為沒食子酸標準品濃度，單位為mg/mL；Y為吸光度，R2=0.9991）總酚含量以每毫升樣品中總酚類化合物相當于沒食子酸的質量表示（mg/mL）。

1.2.5.3 黃酮測定 采用亞硝酸鈉法測定黃酮含量[16]。取樣品50 μL于25 mL比色管中，加入1 mL 5%NaNO2溶液，混勻，在室溫下靜置6 min，加入1 mL 10%AlNO3溶液，搖勻靜置6 min后加入8 mL 4%NaOH溶液，用60% 乙醇定容至刻度線，混勻，室溫下反應15 min，在510 nm處測得吸光度值。根據蘆丁濃度和吸光度值繪制標準曲線。標準曲線方程：y=11.012x?0.0021，（式中y為吸光度的大小，x為標準品蘆丁溶液的濃度，單位為mg/mL，R2=0.999）總黃酮含量以每毫升樣品中黃酮類化合物相當于蘆丁的質量表示（mg/mL）。

1.2.5.4 花色苷含量測定 采用消光系數法[17]對玫瑰花酵素中花色苷進行測定。將發酵得到的玫瑰花酵素用紫外分光光度計在400～800 nm波長范圍內掃描，以蒸餾水為參比，確定玫瑰花酵素花色苷的最大吸收波長。根據式（1）計算玫瑰花酵素中花色苷含量：

式中：C（mg/100 mL）：玫瑰花酵素花色苷含量；A:最大吸收波長處的吸光度值；V1：定容體積（mL）×稀釋倍數；V2：樣品體積（mL）；98.2：花色苷平均消光系數。

1.2.5.5 可滴定酸測定（以乳酸計）參考GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》。

1.2.5.6 pH測定 采用pH計測定。

1.2.6 抗氧化活性測定

1.2.6.1 對DPPH自由基清除作用的測定 參照文獻[18?19]方法略作改動。加入3.2 mL 0.10 mmol·L?1的DPPH工作液于試管中，加入蒸餾水稀釋的玫瑰花酵素溶液0.8 mL，玫瑰花酵素體積分數分別為：0、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%、0.4%、0.45%，混勻后，于25 ℃避光反應30 min，在517 nm波長下測定其吸光度。按式（2）計算DPPH自由基清除率（%）。

式中：A0：DPPH溶液的吸光度；A1：玫瑰花酵素+DPPH溶液的吸光度。

1.2.6.2 對ABTS自由基清除作用的測定 參照文獻[20?21]方法略作改動。取3 mL ABTS+·工作液于試管中，加入蒸餾水稀釋的玫瑰花酵素溶液0.3 mL，玫瑰花酵素體積分數分別為：0、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%、0.4%、0.45%，將其充分混勻后，在25 ℃下避光反應10 min，在732 nm波長處測定樣品的吸光度。按式（3）計算ABTS自由基清除率（%）。

式中：A2：空白（蒸餾水）+ABTS溶液的吸光度；A3：玫瑰花酵素+ABTS溶液的吸光度。

1.2.6.3 總抗氧化的測定 參照方敏[22]李加興[23]等的方法略作改動。取蒸餾水稀釋的玫瑰花酵素溶液0.1 mL于25 mL比色管中，玫瑰花酵素體積分數分別為：0、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%、0.4%、0.45%，與6 mL FRAP溶液混合，在37 ℃水浴30 min，然后在593 nm處測定吸光度值。

1.3 數據處理

每次試驗均進行3 次重復操作，試驗數據處理、統計分析和圖標繪制采用Excel、Design-Expert 8.06、SPSS 20 和Origin軟件。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 發酵溫度對SOD酶活力及總酚含量的影響 如圖1 所示，隨著發酵溫度的不斷上升，SOD酶活力以及總酚含量呈先上升后下降的趨勢，在33 ℃均達到最高，SOD酶活力為90.87 U/mL，總酚含量為5.97 mg/mL。當溫度>33 ℃時，SOD酶活力與總酚含量均呈現大幅下降趨勢。這可能是由于發酵溫度較低時，代謝物SOD酶及總酚含量較低，發酵速度慢；隨著發酵溫度繼續增加，乳酸菌內酶的活性受到高溫的抑制，因此減緩其新陳代謝[24]，使SOD酶活力及總酚合成率下降。發酵溫度對玫瑰花酵素SOD酶活力以及總酚含量的影響具有顯著性（P<0.05）。因此，選擇33 ℃為最佳的發酵溫度。

圖1 發酵溫度對酵素SOD酶活力以及總酚含量的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on enzyme SOD activity and total phenol content

2.1.2 發酵時間對SOD酶活力和總酚含量的影響 如圖2 所示，在一定時間范圍內隨著發酵時間的增加，SOD酶活力與總酚含量增加，在48 h時SOD酶活力最高，且總酚含量最大。之后再延長時間，SOD酶活力與總酚含量均呈下降趨勢。SOD酶活力下降的原因可能是在48 h內乳酸菌處于生長代謝旺盛期，48 h后隨著乳酸菌的密度增高和衰老轉而消耗營養產物，使得次級代謝產物減少，SOD酶活力降低[25]。延長發酵時間可能加速了總酚的氧化分解，導致48 h后總酚含量的下降。發酵時間對玫瑰花酵素SOD酶活力以及總酚含量的影響是顯著的（P<0.05）。因此，選擇48 h為最佳發酵時間。

圖2 發酵時間對玫瑰花酵素SOD酶活力以及總酚含量的影響Fig.2 Effect of fermentation time on the activity of fermented rose SOD and total phenol content

2.1.3 接種量對SOD酶活力與總酚含量的影響 如圖3 所示，隨著接種量的增加，SOD酶活力先增加后減少，總酚含量呈逐漸減少的趨勢。當接種量為0.7 g時，SOD酶活力達到最大值，為93.91 U/mL，總酚含量為5.31 mg/mL。當接種量>0.7 g時，SOD酶活力逐漸降低。這可能是由于接種量過大，菌體正常代謝消耗的營養物質過多，導致發酵產物減少[26]。接種量對玫瑰花酵素SOD酶活力與總酚含量的影響具有顯著性（P<0.05）。綜合考慮，選擇接種量0.4～1 g進行下一步試驗。

圖3 接種量對玫瑰花酵素SOD酶活力與總酚含量的影響Fig.3 Effect of inoculum on the activity of fermented rose SOD and total phenol content

2.1.4 初始pH對SOD酶活力以及總酚含量的影響 如圖4 所示，隨著初始pH的增加，SOD酶活力與總酚含量呈先上升后下降的趨勢，當初始pH為4.4 時，SOD酶活力與總酚含量均達到最大值，此時總酚含量為5.97 mg/mL，SOD酶活力為90.87 U/mL。當初始pH大于4.4 時，隨著pH的增加，總酚含量和SOD酶活力都呈現出逐漸下降的趨勢。這可能是由于初始pH逐漸增加，抑制乳酸菌的生長代謝，活菌數逐漸減少，導致產酶能力降低[27]。初始pH對玫瑰花酵素SOD酶活力以及總酚含量的影響是顯著的（P<0.05）。因此，選擇pH4.4 為最佳發酵初始pH進行后續試驗。

圖4 初始pH對酵素SOD酶活力及總酚含量的影響Fig.4 The effect of initial pH on enzyme SOD activity and total phenol content

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗設計與結果 根據單因素結果，進行響應面設計，試驗設計與結果如表2。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Box-Behnken design and results

利用Design expert軟件對試驗數據進行多元回歸擬合，得到二次多項回歸模型方程:

響應面二次多項回歸方程的方差分析結果如表3 所示，該模型的F=19.25，P<0.0001，表明該模型極顯著；回歸系數R2=0.9506，表明建立的該模型可以較好地擬合試驗的真實情況，自變量與響應值之間關系顯著，該二次方程模型可以用來分析和預測玫瑰花酵素的最佳發酵工藝。由ABCD的F值可知，各因素對玫瑰花酵素綜合品質影響的程度為：B>C>D>A，即發酵時間>接種量>初始pH>發酵溫度。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

2.2.2 響應面交互分析 為直觀反映各因素及其交互作用對SOD酶活力和總酚含量綜合評分的影響結果，對回歸方程繪制三維響應面圖及其等高線，見圖5。

圖5 各因素交互作用對SOD酶活力和總酚含量的綜合評分影響的響應面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour map of the influence of the interaction of various factors on the comprehensive score of SOD enzyme activity and total phenol content

由圖5 可知，發酵溫度與初始pH,發酵時間和接種量，接種量和初始pH之間的交互作用對響應值的影響顯著或極顯著，其他因素兩兩交互作用對響應值的影響不顯著。由圖5a可知，等高線接近圓形，因此確定發酵時間和發酵溫度交互作用不顯著。由圖5b可知，隨著發酵溫度的增加，綜合評分逐漸增加。當發酵溫度超過33 ℃時，綜合評分開始下降。

但隨著發酵溫度和接種量的改變，綜合評分的波動相對較為平穩，由此可知，發酵溫度與接種量之間的交互作用不顯著。由圖5c可知，3D圖像呈是向上凸曲面。初始pH一定時，隨著發酵溫度的升高，綜合評分呈先上升后下降的趨勢；發酵溫度一定時，隨著初始pH的增加，綜合評分先增加，且增大趨勢越來越不明顯，而后減小，從等高線疏密度可知，發酵溫度對綜合評分的影響大于初始pH對綜合評分的影響。兩者之間交互作用顯著。由圖5d可知，發酵時間和接種量之間交互作用顯著，綜合評分在發酵時間32～72 h、接種量在0.4～1 g之間有最大值。由圖5e可知，發酵時間和初始pH之間的交互作用不顯著。由圖5f可知，接種量和初始pH交互作用極顯著。

2.2.3 最佳發酵工藝條件的驗證 由響應面軟件優化玫瑰花酵素發酵工藝條件為：發酵時間67.81 h，初始pH 5.32，接種量1 g，發酵溫度31.27 ℃，該條件下綜合評分為94.88。綜合考慮，調整發酵工藝參數為：發酵時間68 h，初始pH 5.4，接種量1 g，發酵溫度32 ℃。采取該最佳條件進行發酵所得的酵素綜合評分為93.20，即SOD酶活力為（132.07±2.31）U/mL，多酚含量為（6.28±0.29）mg/mL，與理論值無顯著差異（P>0.05），表明可利用此模型對玫瑰花酵素發酵工藝條件進行響應面優化。

2.3 發酵前后理化指標對比

對SOD酶活力、總酚含量、黃酮含量的檢測結果如表4 所示。玫瑰花酵素發酵結束時SOD酶活力達到132.07 U/mL，比發酵前的SOD酶活力提升了4.40 倍。玫瑰花中本身含有黃酮類多酚類物質，是天然的抗氧化活性物質[28]，玫瑰花中的單聚體酚類物質經益生菌的轉化與利用，含量均有所提升。經過發酵，玫瑰花酵素中總酚含量達到6.28 mg/mL，與發酵之前相比，總酚含量提升了45.71%，黃酮含量提升了25.45%。且隨著發酵時間的延長，微生物發酵產生乳酸、有機酸等代謝產物，使反應體系走向成熟，pH從5.40 下降至4.19。

表4 發酵前后理化指標對比Table 4 Comparison of physical and chemical indexes before and after fermentation

2.4 玫瑰花酵素抗氧化活性

2.4.1 DPPH自由基清除能力 DPPH法以氮為中心，是一種靈敏、快速、簡便的評價物質抗氧化活性的方法[29]。由圖6 可知，玫瑰花酵素原液在發酵前后具有較強的DPPH自由基清除能力，且隨著體積分數的增加，DPPH自由基清除率逐漸增加。在相同體積分數下，發酵后的DPPH自由基清除率>發酵前>8 mg/mLVc。這表明，通過發酵，玫瑰花酵素DPPH自由基清除能力得到顯著提升。這可能是與發酵后，玫瑰花酵素總酚、黃酮等活性物質提升有關[30]。發酵前后玫瑰酵素液以及8 mg/mLVc對DPPH自由基清除的半抑制體積分數分別為0.70%、0.30%、1.50%。

圖6 DPPH自由基清除率能力的比較Fig.6 Comparison of DPPH free radical scavenging ability

2.4.2 ABTS自由基清除能力 ABTS經活性氧氧化后會生成一種穩定的藍綠色陽離子自由基—ABTS+·，自由基產生過多或清除過慢，會對生物體產生損害，加速機體的衰老以及誘發各種疾病[31]。抗氧化物的存在會抑制ABTS+·的產生，顏色會隨之變淺，在最大波長734 nm處吸光度值如果減小，表明ABTS+·被清除。如圖7 所示，隨著體積分數的增加，玫瑰花酵素液在發酵前后同Vc一樣對ABTS+·清除率逐漸增強。且在相同體積分數下對ABTS+·的清除率表現為發酵后的玫瑰酵素液最強，其次是發酵前的玫瑰酵素液，最弱的是8 mg/mLVc。發酵前后玫瑰酵素液以及8 mg/mLVc對ABTS自由基清除的半抑制體積分數分別為0.40%、0.20%、6.80%。

圖7 ABTS自由基清除率能力比較Fig.7 ABTS free radical scavenging ability comparison

2.4.3 總抗氧化能力 FRAP法即鐵離子抗氧化能力法。在酸性條件下，抗氧化物還原Fe3+-TPTZ產生藍紫色的復合物—Fe2+-TPTZ，通過測定此復合物在最大波長593 nm處的吸光度，可對抗氧化能力進行評價。吸光度越大，則表明抗氧化能力越強[32]。由圖8 可知，在相同體積分數下，玫瑰花酵素發酵前和發酵后的總抗氧化能力遠高于8 mg/mLVc。且玫瑰花酵素液發酵后的總抗氧化能力大于發酵前的玫瑰花酵素液。

圖8 總抗氧化能力比較Fig.8 Comparison of total antioxidant capacity

3 結論

本文采用響應面法對玫瑰花酵素的發酵工藝進行優化，同時探究玫瑰花酵素的抗氧化活性。優化得到玫瑰花酵素的最佳發酵條件為：發酵溫度32 ℃、發酵時間68 h，接種量1 g，初始pH5.4。在該條件下得到的玫瑰花酵素SOD酶活力達到132.07 U/mL，比發酵前的SOD酶活力提升了4.40 倍，總酚含量達6.28 mg/mL，與發酵之前相比提升了45.71%，黃酮含量為3.48 mg/mL，提升了25.45%。此外，該酵素的ABTS自由基清除率、DPPH自由基清除率以及總抗氧化能力較高，且玫瑰花酵素發酵后的抗氧化能力明顯優于發酵前。說明通過益生菌發酵，可以制備總酚含量與SOD酶活力較高且具有較好抗氧化活性的玫瑰花酵素產品。玫瑰花酵素的研究豐富了以果蔬為主要原料的酵素市場，為玫瑰花資源利用開辟了新途徑。今后的研究中，還可以利用不同的益生菌進行發酵，深入探索玫瑰花酵素的發酵過程酶活性、抗氧化活性以及活性成分的變化，為工業化提供理論依據。