非晶化甲殼素脫乙酰制備高脫乙酰度殼聚糖

許 磊，張文昌，趙 巖，張勁松

（中國科學院金屬研究所，沈陽材料科學國家研究中心，遼寧沈陽 110016）

甲殼素（Chitin）由N-乙酰氨基葡萄糖通過β-1,4 糖苷鍵聚合而成，是自然界第二豐富的有機天然多糖，廣泛存在于蝦、蟹等甲殼動物以及蘑菇等菌類的細胞壁中[1]。甲殼素及其衍生物具有無毒性、生物相容性和生物可降解性等多種優良性能，在食品、生物醫藥、材料、農業、紡織印染等領域具有廣泛的應用前景[2?5]。由于甲殼素具有高度有序的晶體結構和大量的分子間和分子內氫鍵，難溶于水和常見的有機溶劑，其應用受到了很大的限制[6]。殼聚糖（Chitosan）是甲殼素的脫乙酰產物，是甲殼素最重要的衍生物之一，可溶解于部分稀酸中，其應用比甲殼素更為廣泛[7?8]。殼聚糖的脫乙酰度（Degree of Deacetylation，DD）直接影響其溶解度、粘度、離子交換能力和絮凝性等性能，是評價殼聚糖質量的重要技術指標之一。高脫乙酰度（DD>90%）的殼聚糖不僅溶解和離子交換性能良好，還具有更優良的抑菌性[9?10]和生物相容性[11]，主要應用于可食用膜[12?13]和生物醫用材料[14?15]等領域，因此高脫乙酰度殼聚糖具有更高的商業價值。目前殼聚糖主要通過甲殼素非均相脫乙酰反應制備。影響殼聚糖脫乙酰度的參數主要包括反應溫度、NaOH濃度和堿處理方式（處理次數）等[16]。通常為了獲得高脫乙酰的殼聚糖，需要采用堿多次處理的方式[17?18]，其制備工藝更為復雜。

超微粉碎（Superfine grinding）技術利用機械或流體動力的方法克服物料內部凝聚力使之破碎，將粒徑3 mm以上的物料粉碎至100 μm以下，廣泛應用于食品[19?21]、化工[22]、醫藥[23?24]等領域，超微粉碎制備的超細粉具有良好的溶解性、分散性、化學反應活性等特殊性能[25]。甲殼素經超微粉碎處理后，其粒度和結晶度均明顯降低[26]。本研究以超微粉碎處理得到的甲殼素細粉為原料，非均相脫乙酰制備殼聚糖，利用超微粉碎細粉良好的化學反應活性，提高甲殼素非均相脫乙酰反應的效率，減少反應過程中堿的用量（減少排放）和簡化高脫乙酰度殼聚糖的制備工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

α-甲殼素 大連中科格萊克生物科技有限公司，來源于阿拉斯加雪蟹（粘均分子量Mv=535 kDa，脫乙酰度DD=8.32%）；其他試劑 均為AR級。

ZNC-300X碾磨式超微粉碎機 中科耐馳技術（北京）有限公司；Bettersize2600 激光粒度分布儀 丹東百特儀器有限公司；D/max-2500PC X射線衍射儀 日本理學電機（RIGAKU）株式會社；101 型電熱鼓風干燥箱 北京市光明醫療儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 甲殼素的超微粉碎 先將甲殼素用普通粉碎機進行粗粉碎，過篩得到60 目甲殼素（命名為cht-0）。然后取400 g cht-0 置于碾磨式超微粉碎機的碾磨腔中進行超微粉碎。超微粉碎機的轉速設置為40 r/min，電流設置為2.5 A，每隔15 min，收集適量樣品，用于后續的測試和脫乙酰反應研究。根據碾磨時間（15、30、45 和60 min）的不同，總共收集得到4 種甲殼素細粉，依次命名為cht-1、cht-2、cht-3 和cht-4。

1.2.2 甲殼素細粉的XRD（X射線衍射）和粒徑分析

甲殼素細粉（cht-1～cht-4）和60 目甲殼素（cht-0）的XRD采用X射線衍射儀測定。衍射條件為Cu Kα輻射源（λ=0.1542 nm），采用石墨單色器對射線束進行單色化，管電壓為50 kV，管電流200 mA，掃描步長為0.02 °，掃描范圍5～60 °。甲殼素樣品的結晶度按照Ioelovich[27]的方法計算。

甲殼素細粉（cht-4）的粒徑使用激光粒度分布儀測定。將2 mg樣品放入30 mL蒸餾水中，超聲充分分散，然后逐滴加入至充滿蒸餾水的樣品池中。通過控制折光率來調節加入的樣品量，折光率控制在10%～13%，循環水的循環速度為600 r/min。

1.2.3 甲殼素非均相脫乙酰反應制備殼聚糖及反應動力學分析 參考Chang等[28]的方法，具體如下：分別取上述得到的甲殼素粉末（cht-0～cht-4）5 g，放置于100 mL圓底燒瓶中，然后加入50 mL 40wt%的NaOH溶液（甲殼素粉末和NaOH溶液的料液比為1:10），待甲殼素分散均勻后置于一定溫度（90、95 和100 ℃）的油浴鍋中，進行非均相脫乙酰反應。在反應時間為1、2、3 和4 h取出適量的反應物，立即倒入裝有200 mL蒸餾水的燒杯中，使脫乙酰反應停止。反應物用布氏漏斗抽濾，固體部分先用蒸餾水洗滌3 次，再用無水乙醇洗滌2 次，最后60 ℃烘干，得到殼聚糖。

1.2.4 殼聚糖脫乙酰度的測定 采用雙突躍電位滴定法[29]測定殼聚糖的脫乙酰度，計算公式如下：

其中：G：殼聚糖樣品（130 ℃充分干燥）的質量（g）；C：NaOH的濃度（mol/L）；V1：第一突躍點時用去的NaOH標準溶液的體積（mL）；V2：第二突躍點時用去的NaOH標準溶液的體積（mL）；203：N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）的相對分子質量；42：乙酰基的相對分子質量。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 超微粉碎甲殼素的制備和分析

采用XRD分析了甲殼素粉末（cht-0～cht-4）的結晶行為，其譜圖見圖1。由圖1 可知，隨著超微粉碎處理時間的增加，甲殼素在9.2 °處的（020）面和19.2 °處的（110）面的兩個特征尖峰的強度逐漸降低，說明其微觀結構已經破壞[30]。甲殼素粉末cht-0 的結晶度經計算為96.14%，隨著超微粉碎處理，甲殼素的結晶度逐漸降低，最后得到的甲殼素細粉cht-4 的結晶度僅為8.09%，接近于完全非晶化的甲殼素。結晶度降低的原因是碾磨削弱了甲殼素的氫鍵網絡[31]。

圖1 甲殼素粉末（cht-0～cht-4）的XRD譜圖Fig.1 XRD pattern of chitin samples (cht-0～cht-4)

采用激光粒度分布儀分析甲殼素細粉cht-4 的粒徑分布，其粒徑分布圖見圖2（其中累積分布表示小于某顆粒粒徑的百分含量；區間分布表示粒徑區間中某顆粒的百分含量）。甲殼素細粉cht-4 的體積平均徑為41.44 μm，小于60 目甲殼素cht-0 粒徑（250 μm）的五分之一，90%的粒徑低于96.33 μm，已達到超微粉碎的級別。

圖2 甲殼素樣品cht-4 的粒徑分布圖Fig.2 Particle size distribution pattern of chitin sample cht-4

2.2 甲殼素非均相脫乙酰制備殼聚糖

不同反應溫度和反應時間得到殼聚糖產品的脫乙酰度見表1。由表1 可知，隨著甲殼素樣品結晶度的降低，在相同的反應條件下（反應溫度和時間），其制備的殼聚糖的脫乙酰度更高。其中非晶化程度高的甲殼素細粉cht-3 和cht-4，經單次堿處理即可得到脫乙酰度90%以上的殼聚糖，可以大幅降低整個脫乙酰過程中堿的用量，簡化生產工藝。

表1 不同反應溫度和反應時間得到殼聚糖的脫乙酰度（%）Table 1 Degree of deacetylation of chitosan obtained at different reaction temperature and time（%）

2.3 反應動力學分析

甲殼素的非均相脫乙酰反應是與NaOH和乙酰氨基的濃度相關的二級反應，但由于NaOH是遠過量的，通常認為甲殼素的脫乙酰反應為準一級反應[32]（只與乙酰氨基的濃度相關），速率常數與脫乙酰度的關系可以表示為：

式中：DD為反應產物的脫乙酰度（%）；t為反應時間（min）；k為反應速率常數（min?1）。

分別對不同結晶度的甲殼素在90、95 和100 ℃反應溫度下的脫乙酰產物的?ln(1?DD)對反應時間t作圖，得到圖3，圖中直線的斜率即為甲殼素的脫乙酰反應速率，表觀一級反應速率常數見表2。

表2 甲殼素脫乙酰反應的表觀一級反應速率常數Table 2 Apparent first order rate constants of deacetylation of chitin

圖3 甲殼素（cht-0～cht-4）在不同反應溫度下?ln（1?DD）隨反應時間的變化Fig.3 Variation of -ln (1-DD) with reaction time for chitin(cht-0～cht-4) at different reaction temperatures

根據阿倫尼烏斯（Arrhenius）公式計算甲殼素的脫乙酰活化能：

式中，k為反應速率常數；Ea為反應活化能（J/mol）；R為通用氣體常數，8.314 J/(mol·K)；T為熱力學溫度（K）。

分別對不同結晶度的甲殼素的ln k對-1/RT作圖，即可求得反應的活化能。如圖4 所示，甲殼素（cht-0～cht-4）對應的脫乙酰反應活化能分別為58.17、47.23、42.30、35.44 和31.73 kJ/mol，表明隨著甲殼素樣品結晶度的降低，其非均相脫乙酰的反應活性增強。

圖4 甲殼素（cht-0～cht-4）的脫乙酰反應ln k隨-1/RT的變化Fig.4 Variation of ln k in the deacetylation reaction of chitin (cht-0～cht-4) with -1/RT

2.4 非晶化對甲殼素非均相脫乙酰反應的影響分析

根據文獻[28,33?34]報道，甲殼素分子鏈表面的NaOH的濃度是影響脫乙酰效率的主要因素（甲殼素脫乙酰反應歷程如圖5 所示，其中第（1）步反應是可逆過程，需要克服一定的活化能，是整個反應的控速步驟[35]）。隨著脫乙酰反應的進行，NaOH能與低分子電解質（脫乙酰產物）以及多糖分子會形成溶劑化結構，導致甲殼素分子鏈表面NaOH的濃度降低，脫乙酰反應難以繼續進行[36]。因此，即使提高NaOH的濃度和反應溫度，也很難直接得到高脫乙酰度殼聚糖。通常需要多次堿處理減少低分子電解質的含量和溶劑化結構，來實現高脫乙酰度殼聚糖的制備[17?18]。

圖5 甲殼素非均相脫乙酰反應歷程Fig.5 Heterogeneous deacetylation process of chitin

甲殼素經超微粉碎非晶化處理后，結晶度的降低提高了反應產物的擴散速度，有利于乙酰基的脫落和低分子電解質向溶劑中運輸，減少反應過程中形成的溶劑化結構，減緩甲殼素分子鏈表面NaOH的濃度降低速率，從而提高脫乙酰反應的效率（降低反應活化能）。非晶化程度高的甲殼素樣品（cht-3、cht-4）經單次堿處理，即可得到高脫乙酰度（DD>90%）殼聚糖。

3 結論

高脫乙酰度殼聚糖通常需要采用甲殼素經多次堿處理的工藝制備。本研究提供了一種通過超微粉碎處理甲殼素，使其非晶化后再脫乙酰制備殼聚糖的技術路線。非晶化程度高的甲殼素，經過單次堿處理即可得到高脫乙酰度（DD>90%）殼聚糖，可以大幅降低脫乙酰反應過程中堿的用量，簡化生產工藝，具有良好的應用前景。