不同成熟度和產地初加工方法對梔子中4 種活性成分含量的影響

羅靜玲，張湘龍，曾建國，謝紅旗，陸 英,,

（1.湖南農業大學園藝學院，湖南長沙 410128；2.國家中藥材生產（湖南）技術中心，湖南長沙 410128）

梔子（Gardenia jasminoidesEllis）又稱黃梔子和山梔子，主產于湖南、湖北、四川等地，具有利濕除煩、涼血解毒[1]的功效，常用于清熱瀉火藥中[2]。梔子具有豐富的藥理活性成分，對人體有良好的營養保健作用[3]，是首批被納入藥食同源的中藥之一。國內外眾多學者對梔子的化學成分進行了深入研究，從梔子屬植物中提取分離的活性化合物有40 多種，主要有梔子酸[4]、綠原酸[5]、梔子苷[6?8]和西紅花苷Ⅰ[9?10]等。研究表明，梔子苷有保肝利膽[11]、鎮痛消炎作用；梔子酸具有調節血壓[12?13]的功效；綠原酸具有較為廣泛的抗菌[14]、抗病毒、興奮神經和清除人體內自由基[15]的作用；西紅花苷Ⅰ具有涼血解毒[16]、抗癌[17?18]、抗氧化[19]的作用。

梔子采收后需及時處理，否則容易發霉，2020 版《中國藥典》處理方式為：“9～11 月果實成熟呈紅黃色時采收，蒸至上氣或置沸水中略燙，除去果梗和雜質，取出，干燥”，其質量指標為“梔子苷不得低于1.8%”[2]；由此可見，藥典中未明確蒸、煮時間及干燥方法，同時只有一個指標成分的含量要求。為了進一步探討梔子的加工方法，劉濤等[20]以梔子苷及指紋圖譜相似度為指標，對不同采收時間及產地加工方法的樣品進行測定和比較，認為梔子顏色為青黃色時采收的梔子苷含量較高，將藥材水煮后曬干較優；梁獻葵等[21]通過測定梔子苷、西紅花苷Ⅰ及總環烯醚萜苷的含量，確定梔子產地加工最佳蒸制時間為13 min、加明礬水煮8 min。潘媛等[22]以梔子苷、綠原酸和西紅花苷Ⅰ以及抗氧化活性為指標，認為殺青以沸水煮9 min為宜；從文獻可知，這些研究對梔子采收及產地初加工有一定的探討，但缺乏系統性比較，對不同成熟度果實、不同干燥方法特別是常溫儲存一年后成分的變化少有研究。本研究針對文獻的不足，以梔子中4 種主要成分綠原酸、梔子苷、梔子酸和西紅花苷Ⅰ為指標，較系統的從上述幾個方面進行相關研究，旨在為梔子的采收、產地初加工和儲存提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮梔子 采自湖南耒陽富農農業開發有限公司梔子生產基地，于2019 年10 月22 日采收；綠原酸（≥98%）標準品，購自國藥集團化學試劑有限公司；梔子苷（≥98%）標準品，中山市成諾生物科技有限公司；梔子酸（≥98%）標準品，北京精純化工技術研究院；西紅花苷Ⅰ（≥98%）標準品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

AUW220D電子天平 日本島津公司；HPLC：配有SPD-M20A 230V檢測器，色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm），LC-20AT高壓泵，SIL-20A自動進樣器 日本島津公司；KM5200DE超聲波清洗器（功率200 W）昆山美美超聲儀器有限公司；WGL-230B電熱鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 高效液相色譜法（HPLC）測定梔子中4 種活性成分

1.2.1.1 HPLC分析方法 流動相A：0.1%磷酸水，流動相B：乙腈；0→25 min:5%→18% B；25→30 min:18%→32% B；30→40 min:32%→32% B；流速1.0 mL/min，柱溫箱恒溫35℃[23]，進樣量20 μL；檢測波長：梔子酸和梔子苷238 nm[24?25]，綠原酸328 nm[26]，西紅花苷Ⅰ 440 nm[27]。

1.2.1.2 標準曲線繪制方法 精確稱取梔子酸1.40 mg、綠原酸0.94 mg、梔子苷1.04 mg、西紅花苷Ⅰ 0.99 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解，配制成終濃度為0.137、0.092、0.102、0.097 mg/mL的儲備液，臨用前用甲醇稀釋至一定濃度梯度，在1.2.1.1 條件下進樣，記錄峰面積,以進樣質量（mg）為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.1.3 樣品含量測定方法 稱取梔子干燥粉末0.10 g，加入40 mL質量濃度為40%的甲醇，稱定錐形瓶總質量，置于30 ℃超聲提取40 min，提取完畢后用提取液補充至超聲前錐形瓶總質量，搖勻后取溶液過0.45 μm有機濾膜，進樣20 μL。根據標準曲線計算樣品含量，根據含水量[28]換算成干品含量。

1.2.2 梔子中4 種活性成分提取條件的確定

1.2.2.1 甲醇體積分數對提取效果的影響 稱取0.10 g干燥梔子粉末6 份，分別加入50 mL體積分數為0、20%、40%、60%、80%、100%的甲醇溶液，稱定錐形瓶總質量，超聲提取30 min，提取完畢后用提取液補充至超聲前錐形瓶總質量，搖勻后取溶液過0.45 μm有機濾膜，按1.2.1.1 方法進行HPLC測定。

1.2.2.2 料液比對提取效果的影響 稱取0.10g干燥梔子粉末5 份，分別按料液比1:200、1:300、1:400、1:500 加入所需甲醇體積（甲醇體積分數為前一步實驗確定的最佳甲醇體積分數），稱定錐形瓶總質量，超聲提取30 min，提取完畢后用提取液補充至超聲前錐形瓶總質量，搖勻后取溶液過0.45 μm有機濾膜，按1.2.1.1 方法進行HPLC測定。

1.2.2.3 提取時間對提取效果的影響 稱取0.10 g干燥梔子粉末6 份，按最佳甲醇體積分數、最佳料液比加入所需甲醇體積，稱定錐形瓶總質量，分別超聲提取10、20、30、40、50、60 min，提取完畢后用提取液補充至超聲前錐形瓶總質量，搖勻后取溶液過0.45 μm有機濾膜，按1.2.1.1 方法進行HPLC測定。

1.2.3 梔子產地初加工處理方法 選擇中成熟度鮮果分成若干份（每份50 個果）后進行下列不同處理。

1.2.3.1 殺青方法對梔子4 種活性成分的影響 蒸法殺青[29]：預實驗表明，梔子在蒸汽殺青30 s就能達到透心的效果，因此實驗設置最低時間為30 s。取4 份鮮果，置沸水中隔水分別蒸30、60、90、120 s后取出，瀝干水分，置60℃烘箱中烘干[30]。

煮法殺青[29]：預實驗表明，梔子在煮法殺青10 s就能達到透心的效果，因此實驗設置最低時間為10 s。取5 份鮮果，置沸水中分別煮10、20、30、40、50 s后取出，瀝干水分，置60℃烘箱中烘干。

不殺青：取1 份鮮果，置60 ℃烘箱中烘干。

1.2.3.2 不同干燥方法的比較 取7 份鮮果，置沸水中煮10 s后取出，瀝干水分后分別采用曬干、陰干、40、50、60、70、80 ℃烘箱烘干。

1.2.3.3 切制與不切制的比較 取2 份鮮果，置沸水上蒸120 s后取出，其中一份縱向切成兩半，另一份不切，兩份同置60 ℃烘箱中烘干。

1.2.4 不同成熟度梔子中活性成分含量比較 根據梔子果皮色澤分成4 種不同成熟度（青果、輕成熟果、中成熟果、成熟果），各取1 份置沸水上蒸120 s后取出，同置60 ℃烘箱中烘干。

1.2.5 儲存對梔子中活性成分的影響 將干燥樣品室溫避光儲存一年、一年半后測定各成分含量。

1.3 數據處理

采用IBM SPSS Statistics 26.0 分析梔子中4 種活性成分含量的差異。

2 結果與分析

2.1 梔子中4 種活性成分的HPLC分析

經標準品掃描發現，梔子酸和梔子苷最大吸收波長為238 nm，綠原酸為328 nm，西紅花苷Ⅰ為440 nm，因此采用三個波長分別測定該4 種成分。通過洗脫程序調整，在1.2.1.1 色譜條件下目標組分能得到很好分離。不同波長下的梔子甲醇提取液見圖1。

圖1 不同波長下標準品及梔子提取物的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of standards and Gardenia extracts at different wavelengths

2.2 標準曲線的繪制

以化合物質量（mg）為橫坐標（x）,峰面積為縱坐標（y）繪制梔子中4 種活性成分的標準曲線，結果見表1。由表可知，表中化合物的質量與峰面積呈良好的線性關系，可以用于含量測定。

表1 4 種標準品的回歸方程、線性范圍和最低檢出限Table 1 Regresssion equation,linear range and minimum detection limit of four standard substances

2.3 梔子中4 種活性成分同時提取條件確定

2.3.1 甲醇體積分數的確定 由表2 可見，隨著甲醇濃度的升高，梔子中四種活性成分的含量多呈現先升高后降低的趨勢，其中40%～60%甲醇提取綠原酸、梔子苷、西紅花苷Ⅰ沒有顯著性差異(P>0.05)，梔子酸使用40%甲醇提取效果更佳，因此選擇40%甲醇提為提取溶劑。

表2 不同溶劑對梔子中活性成分含量的影響Table 2 Effect of different solvents on the content of active component in Gardenia

2.3.2 料液比的確定 由表3 可見，在實驗濃度范圍內，隨著料液比的增加，梔子中4 種活性成分溶出增大，在使用400 倍溶劑用量后趨于平穩，因此選擇料液比為1:400（g/mL）。

表3 料液比對梔子中活性成分提取的影響Table 3 Effect of material-to-liquid ratio on extraction of active component in Gardenia

2.3.3 提取時間的確定 由表4 可見，提取時間為10～30 min內提取量低，梔子中4 中活性成分提取不充分，提取時間為40～60 min內提取量趨于穩定，因此選擇提取時間為40 min。

表4 提取時間對梔子中活性成分含量的影響Table 4 Effect of extraction time on the content of active component in Gardenia

2.4 產地初加工方法對梔子4 種活性成分的影響

2.4.1 蒸法殺青時間對活性成分的影響 由表5 可知，蒸殺青處理90 s和120 s的4 種活性成分含量之間的差異無統計學意義(P>0.05)；殺青時間越短越有利于梔子酸的保留，對于綠原酸、梔子苷和西紅花苷Ⅰ來說，則需要較長的殺青時間。總體來說，蒸法殺青時間以120 s最佳。

表5 蒸法殺青時間對梔子中活性成分含量的影響Table 5 Effect of steaming fixation time on the content of active component in Gardenia

2.4.2 煮法殺青對4 種活性成分的影響 由表6 可知，在殺青時間30～40 s內4 種活性成分含量相近，除梔子酸和綠原酸含量有所降低外，梔子苷和西紅花苷Ⅰ含量較高。綜合考慮，煮法殺青時間以30 s最佳。

表6 煮法殺青不同時間梔子中活性成分含量Table 6 Effect of boiling fixation time on the content of active component in Gardenia

2.4.3 不同殺青方法對梔子中4 種活性成分含量的影響 由表7 可知，殺青與不殺青對梔子苷和梔子酸無顯著影響(P>0.05)，但殺青樣中綠原酸和西紅花苷Ⅰ顯著高于不殺青樣（P<0.05）；兩種最佳殺青時間處理樣品4 種成分均無顯著差異(P>0.05)。同時，不殺青樣品干燥后放置一段時間后易長霉，因此，梔子干燥前進行殺青處理很有必要。

表7 殺青方式對梔子中活性成分含量的影響Table 7 Effect of fixation methods on the content of active component in Gardenia

2.4.4 不同干燥方法對梔子中4 種活性成分含量的影響 由表8 可知，熱風烘干時，隨著烘干溫度的升高，梔子酸、西紅花苷Ⅰ有下降趨勢，40 ℃最高，50～80 ℃下降但無顯著差異(P>0.05)；綠原酸、梔子苷先升后降然后趨于平穩，50 ℃含量最高；陰干和曬干樣中梔子苷、梔子酸顯著低于烘干(P<0.05)，西紅花苷Ⅰ低于40 ℃烘干但高于其他溫度；綜合考慮，干燥以50 ℃烘干最佳。同時，曬干、陰干樣中梔子苷也高于《中國藥典》標準的1.8%[2]，但陰干樣品在干燥過程中就部分發生霉變，因此，采用曬干方式也是可行的。

表8 不同干燥方法對梔子中活性成分含量的影響Table 8 Effects of different drying methods on the content of active components in Gardenia

2.4.5 切制對梔子中4 種活性成分含量的影響 由表9 可知，切制后干燥的樣品中梔子苷、西紅花苷Ⅰ含量顯著高于不切制干燥樣（P<0.05）。在試驗過程中發現，切制后烘干12 h即可達到干燥效果，不切制需要烘干36 h才達到干燥效果，切制后干燥減少了干燥過程中化合物含量的變化。因此，可以根據加工后儲存時間及條件采取切制加工干燥。

表9 切制對梔子中活性成分含量的影響Table 9 Effect of cutting on the content of active ingredients in Gardenia

2.5 不同成熟度梔子中4 種活性成分含量

由表10 可知，4 種成熟度果中的梔子苷均高于《中國藥典》要求的1.8%[2]，輕成熟果、中成熟果、成熟果中無統計學差異（P>0.05），以中成熟果最高，三者顯著高于青果（P<0.05）；梔子酸和西紅花苷Ⅰ隨果實成熟含量顯著增加（P<0.05），在成熟果中含量最高；綠原酸和梔子苷隨果實成熟有先升后降的趨勢，在輕成熟果中含量最高；因此，綜合來說，梔子采收以中成熟和成熟時采收最佳。

表10 不同成熟度梔子及其活性成分的含量Table 10 Different maturity and active ingredients in Gardenia

2.6 儲存時間對梔子4 種活性成分含量的影響

加工后的梔子果實儲存室溫避光儲存一年后4 種化合物含量差異見表11，不管是煮法殺青還是蒸法殺青、切制還是不切制，梔子酸、綠原酸和西紅花苷Ⅰ儲存一年和一年半后含量較加工完成時沒有顯著變化（P>0.05），而梔子苷含量顯著降低（P<0.05），但仍高于中國藥典標準規定的1.8%[2]。

表11 儲存時間對梔子中活性成分含量的影響Table 11 The effect of storage time on the content of active ingredients in Gardenia

3 結論

本研究優化了梔子中4 種活性成分同時提取的條件和不同產地初加工方式對它們含量的影響。結果表明，梔子應以中成熟和成熟時采收；采用400 倍40%的甲醇超聲提取40 min效果較好；加工方式以切制烘干（50 ℃）并殺青處理最佳，蒸法和煮法兩種殺青效果對梔子中4 種活性成分含量無顯著影響（P>0.05）。雖然不殺青處理也能達到藥典指標梔子苷含量不得低于1.8%[2]，但實踐中不易干燥和保存，且易長霉，因此進行殺青處理很有必要。

經過室溫避光儲存一到一年半后，蒸法殺青和煮法殺青的梔子中梔子酸、綠原酸、西紅花苷Ⅰ的含量有所下降，但沒有顯著差異；梔子苷含量顯著降低（P<0.05），因此，不建議對梔子進行長期儲存。