高效液相色譜法測定番茄醬中番茄紅素含量及其與色度值的相關性

楊雪凡，張 維，仇 凱，王正武,

（1.上海交通大學農業與生物學院，上海 200240；2.中國食品發酵工業研究院有限公司，北京 100020）

番茄紅素（lycopene），分子式為C40H56，是成熟番茄中最主要的疏水性無環類胡蘿卜素，具有多種異構體，而自然界中普遍以全反式存在[1?3]。番茄紅素含有13 個碳碳雙鍵，具有強抗氧化性，是良好的自由基清除劑并能調節免疫系統平衡，目前已有其抗多種癌癥（胃癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌等）的相關報道，因此其生理活性倍受關注[3?6]。番茄是世界上飲食中番茄紅素的主要來源，因此番茄紅素也是番茄制品質量的重要考察指標。

現行的GB/T 14215-2008 標準及已有的相關研究中都將番茄紅素總含量作為番茄制品的品質指標，其不僅提供了營養信息也提供了產品成熟度和新鮮度等質量信息[7?10]。番茄紅素含量測定方法主要有分光光度法和高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC），HPLC法較分光光度法更靈敏準確、可控性和分離度高、可排除其他色素干擾，但兩者均存在前處理繁瑣、番茄紅素穩定性差易造成總量損失的缺點[7,11?13]。目前已有研究中均以番茄紅素總量作為品質評價指標，但是已有研究發現人體中番茄紅素60%以上以順式結構存在，且順式番茄紅素在人體中具有更高的生物利用度及更高的抗氧化性[14?15]，番茄紅素順式異構體含量較番茄紅素總量更是番茄制品品質優劣的重要體現。

同時，番茄紅素也是番茄制品中主要呈色物質，因此色度值也是番茄制品品質劃分的重要指標[16?17]。Li等[18]成功通過結合色度值和番茄紅素含量評價番茄醬貯藏中的品質變化。Fu等[19]也成功通過比色法測定色度值結合番茄紅素總量評價番茄的新鮮度。因此，番茄紅素總含量和色度值都是番茄制品的主要理化指標。此外，番茄制品受加工手段影響大，全面評價番茄制品的品質仍需要檢測可溶性固形物、pH、風味物質、添加劑等指標，但這存在過程繁瑣，耗時長的缺點[18,20?21]。目前光譜檢測不僅有著無損、快速、準確的特點，而且較比色法、HPLC法等能夠獲得更多的產品成分及結構信息，在產品加工及成品品質檢測中有著極大潛力，但仍然存在定量精度遠低于HPLC法的缺點[22?25]。因此，光譜技術仍需要結合HPLC、比色法才能更全面準確地表征番茄制品成分和結構信息[26?28]。本文建立HPLC檢測番茄制品中番茄紅素含量的方法，并研究了番茄紅素含量與色度值間的相關性，為建立光譜同時檢測番茄制品的色度值及番茄紅素含量的方法研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

番茄醬及番茄汁類番茄制品（20 種不同品牌）市售產品；全反式番茄紅素標準品 純度>98%，河南奧科標準物質科技有限公司；二氯甲烷、甲醇 化學純，Greagent；超純水；甲醇、甲基叔丁基醚 MTBE、氫氧化鈉、氯化鈉、無水硫酸鈉、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）、叔丁基氫醌（TBHQ）、丁羥基茴香醚（BHA）其中，甲醇、甲基叔丁基醚 MTBE為色譜純，其余均為化學純，Adamas。

1260 Infinity II液相色譜 配有DAD二極管陣列及數據分析系統，美國安捷倫公司；超純水儀Molecular公司；MS105DU分析天平 MettlerToledo公司；R-1020 旋轉蒸發儀 BUCHI公司；SHB-2IIIA循環水多用真空泵 上海滬西分析儀器廠有限公司；MS-H-S10 磁力攪拌器 DLAB公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理及提取 精確稱取樣品1 g（精確至0.001 g）于 250 mL的錐形瓶中，先加入10 mL 0.5 mol/L的NaOH溶液搖晃均勻，皂化30 min。然后分別加入50 mL蒸餾水和5 mL的飽和氯化鈉，振蕩使溶液分散均勻，用0.6 mol/L的稀鹽酸溶液中和至中性（pH7，20 ℃）。再次加入50 mL的二氯甲烷磁力攪拌30 min后轉入分液漏斗中，靜置20 min，分別收集有機相和水相，重復上述步驟2 次至水相近無色，合并有機相。抽濾水相，殘渣加入甲醇和二氯甲烷1:1 混合溶劑洗滌至無色。合并洗滌液和有機相，加入無水硫酸鈉（約1.0 g）脫水，過濾后并于（40±1）℃旋轉蒸發儀中減壓濃縮，近干。氮氣吹干，并用二氯甲烷定容至5 mL，過膜（0.45 μm）后置于2.0 mL樣品瓶中，放?20 ℃冰箱備檢。

1.2.2 HPLC檢測條件 色譜柱：YMC-C30（4.6 mm×250 mm,5 μm）；流動相A為甲醇，B為MTBE；流速：1.3 mL/min；檢測波長：472 nm；柱溫：20 ℃；進樣量：10 μL；梯度洗脫條件，見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.2.3 標準曲線繪制 準確稱取番茄紅素標準品10.0 mg（精確至0.1 mg），用二氯甲烷溶液溶解并定容至10 mL，得到1000 μg/mL番茄紅素標準液。分別準確移取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2 mL標準儲備溶液，用二氯甲烷稀釋并定容至10 mL，得到濃度為10、20、40、60、80、100、200 μg/mL的標準工作溶液，取樣進行超高效液相色譜分析，測定番茄紅素峰面積，以番茄紅素濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，以此建立標準曲線。

1.2.4 樣品中番茄紅素含量的計算 計算公式為：

式中：X表示樣品中番茄紅素的含量，mg/100 g；fi表示番茄紅素異構體對全反式番茄紅素的校正因子，其值分為1；W表示樣品質量，g；∑A表示樣品中全反式番茄紅素及其異構體的面積之和；c表示稀釋倍數；a表示標準曲線斜率；b表示標準曲線截距。

番茄紅素得率計算公式：

式中：X表示樣品中番茄紅素的含量，mg/100 g；M表示樣品質量，g。

1.2.5 樣品色度值測定 每個樣品取適量置于測試容器中，色差儀經黑白瓷片校準后進行L*、a*、b*值的測定，平行3 次取均值。并根據測得的L*、a*、b*值計算Chroma值和色相H°值：

1.3 數據處理

運用Excel、SPSS 20 及originPro 2017 軟件進行圖形繪制及數據分析。

2 結果與分析

2.1 前處理方法建立

2.1.1 提取溶劑選擇 以番茄醬為原料，使用四種有機溶劑按照1.2.1 方法進行提取（n=9），提取結果見圖1。從圖1 可知，以二氯甲烷作提取溶劑所得番茄紅素含量為23.03 mg/100 g（RSD=4.5%）均高于其他提取溶劑所提取出的含量，因此二氯甲烷提取效率最高，所以本實驗最終選擇二氯甲烷為提取溶劑。

圖1 提取溶劑選擇（n=9）Fig.1 The selection of solvent (n=9)

2.1.2 抗氧化劑的選擇 為提高番茄紅素在提取過程中的穩定性，分別選擇0.5 g/L的叔丁基對苯二酚（TBHQ）、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT)、丁羥基茴香醚(BHA)作為抗氧化劑添加入二氯甲烷溶劑中，測定同一番茄醬樣品的番茄紅素含量，由圖2 可知，未添加抗氧化劑的樣品提取的番茄紅素含量為23.03 mg/100 g高于添加抗氧化劑樣品的提取結果，因此抗氧化劑的效果均無顯著提高，選擇不添加。

圖2 抗氧化劑選擇（n=6）Fig.2 Selection of antioxidants (n=6)

2.2 高效液相色譜檢測方法建立

2.2.1 最大檢測波長的確定 由圖3 可知，番茄紅素的最大吸收峰在472 nm處，因此，選擇472 nm為紫外檢測波長，進行檢測。

圖3 番茄紅素及其異構體色譜圖及紫外吸收光譜圖Fig.3 Chromatogram and ultraviolet absorption spectra of lycopene and its isomers

2.2.2 檢測條件的優化實驗 選擇甲醇-甲基叔丁基醚作為流動相體系，選擇三個流速梯度0.8、1.0、1.3 mL/min進行實驗，考察不同流速對檢測效率的影響，如圖4 所示，提高流速可有效縮短樣品中番茄紅素特征峰的保留時間，由于圖4（a）中1.3 mL/min流速下的色譜峰較其他兩個流速下的色譜峰分離效果和峰形更好，且保留時間最短，因此效率最高，故選擇流速1.3 mL/min為最終的色譜檢測條件。

圖4 不同流速下檢測樣品中番茄紅素色譜圖Fig.4 Chromatogram of lycopene in the samples was determined at different flow rates

2.2.3 檢測方法對比 采用1.2.1 的提取條件，選擇1.2.2 檢測方法（方法1）、GB/T 14215-2008 的分光光度法（方法2）以及GB/T 22249-2008 的HPLC檢測方法（方法3，使用C18色譜柱）檢測市售的4 個不同品牌的番茄醬制品中番茄紅素含量（表2），結果表明，方法1 的相對標準差在2.0%～4.4%之間，方法2 的相對標準差在0.9%～4.1%，方法3 的相對標準差在2.6%～5.5%之間，均具有良好的重復性。但采用C30色譜柱的方法1 測定的4 個樣品的番茄紅素總含量在11.13～72.51 mg/100 g之間，高于方法2 的8.80～46.23 mg/100 g和方法3 的8.89～54.28 mg/100 g。方法1 較方法2 番茄紅素含量提高了26.48%～56.85%，相較于方法3 番茄紅素含量提高了25.20%～33.59%。目前研究表明C30柱在番茄紅素及其異構體的分離中有獨特優勢,可成功分離7 種以上番茄紅素及其異構體[11,29?30]，因此，本文將以C30柱作為固定相研究番茄紅素及其異構體的高效液相色譜分離檢測方法。實驗結果由圖5 可見，C18柱相比于C30柱無法分離番茄紅素及其異構體，峰形較差。

圖5 不同檢測方法檢測樣品中番茄紅素的色譜圖Fig.5 Chromatogram of lycopene in samples was determined by different methods

表2 不同市售番茄醬制品中番茄紅素的3 種檢測方法測定結果的比較（n=9）Table 2 Comparison of results obtained for determination of lycopene by HPLC in commercially available ketchup from three different manufacturers (n=9)

2.3 方法學驗證

2.3.1 線性范圍、檢出限和定量限 按照1.2.3 方法建立標準曲線，得番茄紅素標準曲線為y=68.23x+33.125，R2=0.9997，滿足定量要求；檢出限（LOD）指被分析物被檢測出的最小質量或濃度，通常被定義為信噪比（S/N）比值為3，定量限（LOQ）要求S/N比值一般為10。測定得LOD為0.15 μg/mL，定量限為0.25 μg/mL。

2.3.2 重復性測定 取三種市售不同品牌的樣品，同一樣品取9 份平行進行HPLC檢測，記錄峰面積值，按番茄紅素標準曲線計算含量及相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）結果如表3 所示，相對標準偏差在2.8%～4.5%之間，表明該方法有良好的重復性。

表3 HPLC方法的重復性實驗結果（n=9）Table 3 Results of repeatability obtained by HPLC (n=9)

2.3.3 加標回收率檢測 采用加標回收實驗對方法的準確度進行評價，向已知含量的樣品中加入番茄紅素標準液，按照樣品處理方法對加標樣品預處理后，采用超高效液相色譜儀進行測定，重復6 次，以峰面積計算含量、加標回收率。

由表4 可知，四種目標物的平均回收率為98.3%～99.6%，表明此檢測方法準確度良好。

表4 番茄紅素加標回收率實驗結果（n=6）Table 4 Recovery of lycopence by HPLC (n=6)

2.4 番茄制品色度值與番茄紅素總含量的相關性研究

2.4.1 樣品中番茄紅素含量測定及色度值測定 采用本實驗建立的方法對市售20 種番茄制品（番茄醬、番茄汁）樣品進行番茄紅素含量的檢測，結果如表5 所示。由表可知市售番茄制品的番茄紅素含量為2.05～ 72.51 mg/100 g，亮度L*為15.83～39.79，色差值a*/b*在0.59～1.24 之間，總體顏色偏紅，且L*和a*、a*/b*值越高，番茄制品顏色越鮮紅好看。

表5 色度值及番茄紅素含量檢測結果（n=3）Table 5 Chromaticity values and content of lycopene in samples (n=3)

2.4.2 番茄紅素異構體分布情況 通過液相色譜圖獲得各異構體在番茄制品中的含量，由表6 可知，首先，市場番茄制品中主要的番茄紅素為全反式結構，所測定的20 種番茄制品所含的番茄紅素中76.41%～93.36%為全反式番茄紅素，其余主要為5z、9z、13z三種順式結構的異構體。所測定樣品中0%～11%為5z-番茄紅素，0%～6%為9z-番茄紅素，2%～14%為13z-番茄紅素。番茄制品中反式番茄紅素平均總占比88.06%，順式番茄紅素平均總占比達11.94%，而Gregory等[31]發現天然生番茄中反式番茄紅素占比為89.70%，順式番茄紅素占比10.30%，可以看出番茄制品由于加工及儲藏等因素使部分反式番茄紅素出現了順式異構化，且順式番茄紅素在人體中生物利用度比全反式高，因此番茄制品中順式異構體的存在對于總番茄紅素含量計算是不容忽視的。

表6 番茄紅素及其異構體在番茄制品中的分布情況（n=3）Table 6 Distribution of lycopene and its isomers in tomato products (n=3)

2.4.3 相關性分析 測得樣品色度值如表7 所示，將測得的不同品牌番茄制品色度值與其番茄紅素含量進行Pearson相關性分析，結果表明番茄醬的番茄紅素含量與其紅值a*和Chroma值有極為顯著的正相關（P<0.01），與a*/b*、H°值有顯著的正相關（P<0.05），表明a*越高，番茄醬紅色越深則其番茄紅素含量越高，而番茄紅素與藍值b*、亮度值L*、（a*/b*）2值無顯著相關性。

表7 番茄制品中番茄紅素含量與色度值的相關性分析Table 7 Correlation analysis between color value and content of lycopene of tomato products

2.4.4 回歸分析 將番茄紅素含量分別與a*、a*/b*、Chroma、H°值分別進行回歸分析，結果如表8 所示，經過線性和非線性（二次項、三次項、冪函數、指數）回歸分析發現，a*與番茄紅素含量的三次回歸分析得到最好的R2=0.689，未達到良好的擬合效果。因此，番茄紅素含量與番茄制品的色度值間相關性不強，可能是由于原料、添加劑、加工方法等不同而導致成品色度值差距較大。因此，番茄制品的色度值不能單獨作為番茄制品中番茄紅素含量的評價標準。

表8 線性回歸分析結果Table 8 Regression coefficients of chromaticity values

3 結論

采用高效液相色譜法建立了對番茄醬制品中番茄紅素含量檢測方法，并進行了方法學評價。通過優化前處理條件及檢測條件，最終獲得的方法檢測限為0.15 μg/mL、定量限為0.25 μg/mL，加標回收率在98.3%～99.6%之間，相對標準偏差在2.8%～4.5%之間，則該方法有良好的靈敏度、重復性和準確性，且分離了番茄制品中主要的四種番茄紅素異構體，表征了更具體的番茄紅素營養信息，適用于市售番茄醬及番茄制品中番茄紅素含量的精確測定。番茄紅素含量與紅值a*、a*/b*、Chroma、H°值間存在正相關（P<0.05），與L*、b*值無明顯相關（P>0.05），但經過線性及非線性回歸分析發現a*和番茄紅素含量的三次回歸達到最佳擬合效果（R2=0.689）。由于不同原料、加工手段及添加劑的添加導致市售番茄制品的色度值和實際番茄紅素含量相關性較差，單一的番茄紅素含量無法替代番茄醬中色差值的檢測，需要完善番茄醬中其他色素，如β-胡蘿卜素、葉黃素等色素的相關方法。