高效液相色譜-蒸發光檢測器法測定雞蛋中卵磷脂的含量

孔凡華，王 軒，于連洋，白沙沙，徐佳佳，楊春雪，李 東，崔亞娟,

（1.北京市營養源研究所，北京 100069；2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；3.北京城市學院生物醫藥學部，北京 100083）

卵磷脂是從植物或動物中提取出來的磷脂混合物，包括磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰肌醇（PI）、鞘磷脂（SM）及其他磷脂[1]，天然卵磷脂廣泛存在于動植物體內，以蛋黃、大豆內含量較多。按照原料的不同，分為蛋黃卵磷脂、大豆卵磷脂和菜籽卵磷脂。蛋黃卵磷脂是從蛋黃中提取并精制得到的天然磷脂混合物，主要為磷脂酰膽堿，蛋黃磷脂的脂肪酸組分大多為棕櫚酸、油酸，其次為硬脂酸、亞油酸，并且還含有微量的花生四烯酸（AA）和二十二碳六烯酸（DHA）等多不飽和脂肪酸及奇數碳脂肪酸[2]。蛋黃卵磷脂具有抗氧化[3]、抗菌[4]、抗炎[5]、提高人體記憶和認識功能[6]、降低血壓[7]和預防肥胖癥[8]等重要的生理功能。

目前，磷脂的檢測方法主要有紫外可見分光光度法[9]、薄層色譜法[10]、液相色譜法[11?12]、核磁共振法[13]、紅外光譜法[14]和質譜分析法[15?16]，其中高效液相色譜法靈敏度高、穩定性和重現性好，是最為有效的檢測方法。現行國家標準方法有GB/T 35867-2018[17]《糧油檢驗 卵磷脂中磷脂含量的測定 高效液相色譜蒸發光散射檢測法》適用于粗制含油卵磷脂、無油卵磷脂和從植物油脂中提取的卵磷脂的測定；GB 5009.272-2016[18]《食品安全國家標準 食品中磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇的測定》適用于含油大豆磷脂、脫油大豆磷脂、大豆油、菜籽油、花生油、葵花籽油中磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰肌醇（PI）的測定；SN/T 3851-2014[19]《出口食品中磷脂的測定 比色法》適用于肉制品、豆制品、乳制品、雞蛋、花生、糖果等中磷脂含量的測定，只能測定雞蛋中的總磷脂的含量，不能測定磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺的含量；NY/T 2004-2011[20]《大豆及制品中磷脂組分和含量的測定 高效液相色譜法》適用于大豆及制品（豆腐、豆漿、腐乳等）中磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇的測定；GB/T 5537-2008[21]《糧油檢驗 磷脂含量的測定》適用于植物原油、脫膠油及成品油中磷脂的測定。上述標準方法主要集中在大豆卵磷脂和菜籽卵磷脂的檢測，尚缺少蛋黃卵磷脂檢測的標準方法。

蛋黃卵磷脂具有重要的生理功能，成為人們關注的熱點，蛋黃卵磷脂的研究起步較晚，目前國內蛋黃卵磷脂的檢測多采用紫外分光光度法[22?23]，利用最大吸收波長對卵磷脂進行定量分析，由于卵磷脂的紫外吸收波長較低，處于紫外吸收波長的末端，容易受到其他溶劑的干擾，影響定量結果。劉穎等[23]通過薄層色譜法定性檢測蛋黃卵磷脂，但由于薄層色譜法需要較高的點樣技術，且成功率低，使結果重現性差。示差折光檢測器（RI）在定量分析卵磷脂時有一定的優勢，但該檢測器對溫度敏感且靈敏度低，儀器平衡時間長，基線不容易穩定，限制了示差折光檢測器的使用。龔雁等[24]報道了蛋黃中卵磷脂測定的HPLC-ELSD法，但是只建立了蛋黃中PC的檢測方法，沒有建立PE的檢測方法，方法測得PC的加標回收率為98.2%～128.2%，方法準確度較低，且流動相體系用到了正己烷，大部分液相系統的密封圈不耐受正己烷溶液，限制了方法的使用。ELSD是通用型檢測器，不容易受溶劑體系、梯度洗脫和基線干擾，具有高分辨率和快速分離的優勢，是檢測卵磷脂的理想檢測器，本研究優化了HPLC-ELSD測定蛋黃卵磷脂的色譜條件，以雞蛋為研究對象，進行方法學驗證，考察方法的科學性、準確性和適用性，并通過測定已知磷脂含量的雞蛋樣品，對比研究蒸發光檢測器和紫外檢測器測定結果的準確性，以期建立雞蛋中磷脂的精準分析檢測技術。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞蛋樣品 采自超市；乙腈、甲醇、異丙醇 色譜純，美國Fisher公司；磷脂酰膽堿標準品（純度>99%）、磷脂酰乙醇胺標準品（純度>98%）Sigma公司；氯化鈉、氯仿、甲醇、乙酸、乙醚 分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

EYELA MMV-1000W振蕩器、EYELA N-1100 旋轉蒸發儀 東京理化株式會社；Agilent 1260 高效液相色譜儀、蒸發光檢測器和ChemStation for LC systems（版本序列號：Rev.B.04.03-SP2 [105]）色譜工作站 美國Agilent公司；Cleanert氨基固相萃取柱 天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 雞蛋中總脂肪的提取 雞蛋樣品中總脂肪的提取參考Folch等[25]的方法。準確稱取混勻的雞蛋樣品5 g（精確到0.0001 g），加入100 mL氯仿-甲醇（2:1,v/v），混勻并超聲（功率為100 W）35 min，抽濾并收集濾液，用氯仿-甲醇（2:1,v/v）溶液重復清洗濾渣，將所收集濾液全部混合并入分液漏斗中。向分液漏斗中加入適量質量分數為0.9%的氯化鈉溶液，振蕩搖勻，靜止30 min后，收集下層氯仿層，重復以上操作兩次，將氯仿層合并，旋轉蒸干。

1.2.2 雞蛋中磷脂的純化 磷脂的純化參考GB 5009.272-2016[18]方法，將50 mL氯仿加入到收集的總脂肪中，渦旋混合均勻，將10.0 mL油脂氯仿溶液移入氨基硅膠固相萃取柱中，然后依次用2.0 mL氯仿-異丙醇（2:1,v/v）混合溶液和3.0 mL的乙酸-乙醚（2:144,v/v）混合溶液淋洗小柱，然后用3.0 mL甲醇洗脫出磷脂，再重復4 次，收集洗脫液。洗脫液在45 ℃旋轉蒸發儀上蒸至近干，轉為氮吹，吹干后加入10.0 mL甲醇溶液溶解，在4000 r/min下離心5 min，取上清液用于液相色譜分析。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：Intersil SIL-100A色譜柱（4.6 mm×100 mm,5 μm）；流速為0.8 mL/min；柱溫30 ℃，ELSD采用分流模式，以空氣作為霧化氣，氣體流速1.7 L/min，漂移管溫度45 ℃；進樣量為20 μL；流動相A：乙腈-異丙醇（55:5,v/v），流動相B：甲醇-異丙醇（35:5,v/v），洗脫程序為：0～14 min，A由70%變換至0，B由30%變換至100%；14～24 min，100% B保留10 min；24～25 min，A由0 變換至70%，B由100%變換至30%；25～45 min，70% A保留20 min。

1.2.4 方法驗證 按照GB/T 27404-2008 《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》[26]方法學要求，建立校準曲線及校準曲線的工作范圍；逐步稀釋樣品上機測定，R（S/N）=3 時的測定濃度作為檢出限，R（S/N）=10 時的測定濃度作為定量限；稱取雞蛋樣品，按照實驗優化的方法，平行測定6 次，計算磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺的含量和相對標準偏差，考察方法的重現性；根據雞蛋中磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺的含量，按本底值的0.5 倍、1 倍、1.5 倍三個濃度水平，進行三水平六平行加標回收實驗，以回收率的高低評價方法的準確度。

1.2.5 ELSD和UV檢測方法比較研究 鑒于目前磷脂標準檢測方法多采用紫外檢測法[18?21]，本實驗進行了ELSD和UV檢測方法的比較研究，參照GB 5009.272-2016[18]，UV檢測波長被選擇205 nm，其他色譜條件不變，選取已知PC和PE含量的雞蛋質控樣品（質控樣品由客戶提供），PC和PE標示含量分別為20 mg/g和9 mg/g，按1.2.1 和1.2.2 前處理方法提取純化磷脂后，平行測定6 次，分別進HPLCELSD和HPLC-UV液相系統分析，測定樣品中PC和PE的含量。

1.2.6 實際樣品的測定 選取市售不同品種的雞蛋，按1.2.1 和1.2.2 提取純化卵磷脂，按1.2.3 色譜條件進行液相色譜分析，計算不同品種雞蛋中磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺的含量。

1.3 卵磷脂含量的計算

1.3.1 標準曲線的制作 將磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺標準系列工作液，按1.2.3 色譜條件進行液相色譜分析，根據磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺的保留時間定性，以標準工作溶液的濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，外標法定量。

1.3.2 結果計算 試樣中磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺的含量X以質量分數計，按下式計算：

式中：X-試樣中磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺的含量，mg/g；ρ-從標準工作曲線上得到的磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺的濃度，mg/mL；V-試樣溶液的體積，mL；m-試樣的質量，g；f-稀釋倍數。

1.4 數據處理

通過與儀器配套的ChemStation for LC systems工作站軟件完成數據的采集與處理。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

HPLC法是卵磷脂分離和定量的常用方法，基于磷脂分子頭部基團極性大小和磷脂上脂肪酸酰基鏈疏水性的不同，可以采用正相或反相系統洗脫。文獻報道[27]，磷脂分離常用的流動相體系為正己烷-異丙醇-水、乙腈-甲醇-水、氯仿-甲醇-水（氨水），考慮到氯仿-甲醇-水（氨水）體系ELSD基線噪音比較高[24]，優先選擇其他兩種流動相體系。參考Zhou等[28]的方法，配制PC和PE混合標準溶液，甲醇-乙腈等度洗脫，結果顯示，PC和PE可以達到基線分離，但兩個峰間隔近20 min，且PE的色譜峰與溶劑峰非常接近。異丙醇具有改善峰形的作用，在流動相中加入少量異丙醇可以延長溶劑峰與目標峰的距離，故選擇甲醇/乙腈/異丙醇梯度洗脫，PC和PE的標準色譜圖和樣品色譜如圖1 和圖2，可見PC和PE在優化的流動相體系下峰形良好，適合定量分析。

圖1 PC和PE標準溶液液相色譜圖（HPLC-ELSD）Fig.1 Chromatogram of phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine（HPLC-ELSD）

圖2 雞蛋中PC和PE液相色譜圖（HPLC-ELSD）Fig.2 Chromatogram of phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine in egg（HPLC-ELSD）

2.2 方法學驗證

2.2.1 線性關系、檢出限及定量限 按1.2.1 和1.2.2提取純化卵磷脂，在1.2.3 色譜條件下進行HPLC分析，得到磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺分別在0.052～1.031、0.041～0.823 mg/mL范圍內，濃度與峰面積有良好的線性關系，PE的線性回歸方程為y=0.0001x+0.0557，PC的線性回歸方程為y=0.0002x+0.0677，回歸系數均大于0.99，PC和PE的檢出限分別為0.75 mg/g和0.60 mg/g，定量限分別為2.50 mg/g和2.00 mg/g。

2.2.2 精密度和重復性 取標準儲備液，按照1.2.3色譜條件進行測定，重復測定6 次，PC和PE的峰面積的相對標準偏差（RSD）分別為2.55%和2.50%，表明儀器精密度良好，結果見表1。準確稱取同一雞蛋樣品6 份，測定樣品中PC和PE含量，結果顯示雞蛋中PC和PE含量及保留時間的RSD均小于5%，表明方法重復性良好，結果見表2。

表1 PC和PE的峰面積及其RSD%（n=6）Table 1 Peak area and RSD% of PC and PE (n=6)

表2 雞蛋中PC和PE的含量及保留時間（n=6）Table 2 Content and peak time of PC and PE in egg (n=6)

2.2.3 方法準確度實驗 采用樣品加標試驗進行本方法準確度驗證，結果見表3，由表3 知，雞蛋中PC的回收率為93.0%～101.8%，平均回收率為97.4%，RSD為2.66%，PE的回收率為96.7%～106.7%，平均回收率為102.1%，RSD為3.99%，結果表明PC和PE準確度高，相對標準偏差小，適合雞蛋中PC和PE含量的測定。

表3 雞蛋加標回收率實驗結果（n=6）Table 3 Results of recovery rate in egg (n=6)

2.3 ELSD和UV檢測測定結果

選取PC和PE標示含量分別為20、9 mg/g雞蛋質控樣品，HPLC-ELSD測定PC和PE結果分別為21.9～24.2 mg/g和9.12～10.4 mg/g，HPLC-UV測定PC和PE結果分別為28.6～32.3 mg/g和13.7～14.8 mg/g，HPLC-ELSD測量結果更符合標示值，HPLC-UV和真值差別較大，這可能是因為卵磷脂處于紫外吸收波長的末端，紫外檢測很容易受到溶劑和環境等因素的干擾，導致結果誤差大，可見，蒸發光散射檢測器更適合蛋黃卵磷脂的測定，本研究與龔雁等[24]研究結果相吻合。

2.4 樣品的測定

不同雞蛋中PC和PE的含量見表4，由表4 可知，不同品種雞蛋中PC和PE含量差別較大，這是因為雞的產地、品種和飼料等會影響蛋黃卵磷脂脂肪酸的組分，從而影響蛋黃卵磷脂的含量，張琳等[29]研究發現黃酮類化合物可以提高蛋黃卵磷脂的含量。

表4 雞蛋中PC和PE的測定結果（n=3）Table 4 Content of PC and PE in eggs (n=3)

3 結論

蛋黃卵磷脂被廣泛應用于醫療保健領域，目前，尚未建立蛋黃卵磷脂檢測的標準方法，本實驗采用反相色譜系統梯度洗脫，ELSD檢測器檢測，實現了對蛋黃卵磷脂中PC和PE的準確定量。甲醇-乙腈-異丙醇體系，對液相色譜儀器要求低，普適性強。建立的回歸方程相關系數均大于0.99，PC和PE的檢出限分別為0.75 mg/g和0.60 mg/g，定量限分別為2.50 mg/g和2.00 mg/g；雞蛋中磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺精密度的相對標準偏差（RSD）分別為2.55%和2.50%，加標回收率分別為93.0%～101.8%和96.7%～106.7%。測定已知磷脂含量的雞蛋樣品，結果顯示，與HPLC-UV相比，實驗建立的HPLCELSD方法測定結果符合標示值，表明實驗建立的方法可以對蛋黃卵磷脂準確定量。