一種復(fù)方中草藥對阿爾茲海默癥模型小鼠認(rèn)知功能障礙及腸道菌群的影響

張維捷，謝興非，閆 鶴

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510000）

阿爾茲海默癥是中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種常見的進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，患者主要有認(rèn)知功能障礙、記憶力逐漸衰退、行為異常及社交障礙等癥狀[1?2]。目前全球有超過4600 萬人受阿爾茲海默癥影響（alzheimer’s disease,AD）[3]，但仍沒有對阿爾茲海默癥的治療方法。

近年來越來越多的研究表明腸道菌群失調(diào)對腦缺血、帕金森病、阿爾茨海默病等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生重要影響[4]。有研究表明阿爾茲海默癥患者相比于正常人其腸道菌群的物種豐富度和多樣性都有所降低，其中雙歧桿菌豐度顯著減少[5]。此外，阿爾茲海默癥患者體內(nèi)的促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、CXCL2 和NLRP 3 水平相對較高，抗炎細(xì)胞因子IL-10 水平相對較低[6]。而阿爾茲海默癥患者腸道菌群中大腸桿菌與志賀氏菌（Escherichia/Shigella）的豐度比值與促炎細(xì)胞因子IL-1β、CXCL 2 和NLRP 3 的水平呈正相關(guān)；直腸真桿菌（E.rectale）的豐度與IL-1β、CXCL 2 和NLRP 3 水平呈負(fù)相關(guān)，與IL-10 呈正相關(guān)[7]。腸道菌群組成的改變可能導(dǎo)致腸道屏障和血腦屏障通透性增加，另外有些腸道菌群還會產(chǎn)生淀粉樣蛋白、脂多糖和其他毒素，促進(jìn)炎癥反應(yīng)及對大腦的毒性作用，進(jìn)而影響大腦功能[8?13]。另外腸道菌群還可能直接通過合成各種神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)節(jié)劑（如5-羥色胺、褪黑素和γ-氨基丁酸）影響大腦的功能[14]。Akbari等[15]的研究顯示補(bǔ)充嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei），雙岐桿菌（Bifidobacterium bifidum）的阿爾茲海默癥患者中血漿MDA和血清hs-CRP水平顯著降低，且其認(rèn)知功能、炎癥反應(yīng)和代謝狀態(tài)得到改善。綜上可知，腸道菌群與阿爾茲海默癥有緊密聯(lián)系，且某些特定腸道菌群可能是治療阿爾茲海默癥的助劑。

包括多種藥食同源成分的復(fù)方中草藥如復(fù)方C地黃、開心散、益智湯等可能通過多種作用機(jī)制發(fā)揮對阿爾茲海默癥的改善作用。前人研究發(fā)現(xiàn)開心散可顯著降低東莨菪堿所致的小鼠腦組織一氧化氮合酶表達(dá)升高，抑制膽堿酯酶活性，說明開心散可能具有調(diào)節(jié)膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)活動的功能從而起到保護(hù)神經(jīng)元、促進(jìn)記憶的作用，并在AD治療中發(fā)揮優(yōu)勢[16]。此外，益智湯能顯著增高老年性癡呆模型大腦皮質(zhì)和海馬錐體細(xì)胞的尼氏體含量，改善學(xué)習(xí)記憶關(guān)鍵腦區(qū)的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)，從而發(fā)揮神經(jīng)元營養(yǎng)和保護(hù)作用[17]。逍遙散是由白術(shù)、茯苓、白芍等包含多種食品成分組成的一種傳統(tǒng)復(fù)方中草藥，有研究發(fā)現(xiàn)逍遙散亦可通過調(diào)節(jié)腦部乙酰膽堿酯酶的活性來達(dá)到防治阿爾茲海默癥的作用[18]。另外，沈小麗等[19]研究發(fā)現(xiàn)逍遙散通過提高盲腸處動物乳桿菌（Lactobacillus animali）、伯克霍爾德氏菌（Burkholderiales bacterium）的相對豐度來調(diào)節(jié)抑郁模型大鼠的腸道功能。但逍遙散對阿爾茲海默癥模型腸道菌群的作用還知之甚少。

本研究采用Morris水迷宮行為學(xué)試驗(yàn)檢測小鼠認(rèn)知功能的變化、并對小鼠糞便菌群基因組16S rRNA V4～V5 區(qū)進(jìn)行系統(tǒng)分析，旨在探究以逍遙散為基礎(chǔ)的復(fù)方中草藥（Compound Chinese Herbal Medicine,CCHM）對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而基于腸道菌群探究其改善阿爾茲海默癥癥狀的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗(yàn)小鼠：SPF級APP/PS-1 雙轉(zhuǎn)基因雄性C57BL/6 小鼠8 只（灰黑色）、同批出生野生型正常C57BL/6 小鼠5 只 廣東省南模中心提供，許可證號：SCXK（粵）2015-0001，飼養(yǎng)于暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理中心，在有充足食物與水，溫度為(23±2) ℃和濕度為 45%±10% 的空間里以12 h光照處理/12 h黑暗處理的周期進(jìn)行培養(yǎng)，動物實(shí)驗(yàn)是按照中國動物實(shí)驗(yàn)監(jiān)督委員會制定的指導(dǎo)方針進(jìn)行的；復(fù)方中草藥是一個以逍遙散方為基礎(chǔ)的復(fù)方，由組分Ⅰ和組分Ⅱ兩部分組成：組分Ⅰ是逍遙散方（主要包含八種中草藥：北柴胡30 g、當(dāng)歸30 g、白芍30 g、白術(shù)30 g、茯苓30g、甘草15 g、生姜10 g、薄荷10 g）的提取產(chǎn)物；組分Ⅱ?yàn)榫G茶提取物，主要活性物質(zhì)為綠茶多酚，茶多酚含量為50%，兒茶素含量為44%，沒食子酸酯含量為18%，咖啡因含量為8%；QIAmp DNA Stool Mini Kit、Qiagen Gel Extraction Kit純化試劑盒 德國Qiagen公司。

Gene Amp PCR system 2700 美國Applied Biosystem公司；核酸電泳儀、Gel Doc EQ凝膠成像系統(tǒng) 美國BIO-RAD公司；NanoDrop 2000、高速離心機(jī) 美國Thermo公司；HiSeq 2000 DNA測序儀 美國Illumina公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 中草藥提取 參考劉偉[20]的試驗(yàn)方法進(jìn)行組分Ⅰ的提取，流程包括：取適量中草藥與蒸餾水以1:10（W:V）混合，浸泡2 h；水煎2 h，收集水煎液；向藥渣中加入8 倍體積的蒸餾水再提取2 次，每次水煎1 h即可；合并3 次水煎液，50 ℃下濃縮至膏狀，噴霧干燥成干粉并包裝。其提取物的主要活性成分包括阿魏酸（0.05 mg/g）、芍藥苷（4.88 mg/g）和橙皮苷（5.14 mg/g）等。參考Cheng等[21]提供的試驗(yàn)方法進(jìn)行組分Ⅱ中綠茶多酚的提取。

1.2.2 動物分組及處理 將野生型（wild-type,WT）正常小鼠設(shè)為WT組（n=5）；AD模型小鼠隨機(jī)分成兩組：一組為AD組（n=5），另一組為CCHM組（n=3），并接受復(fù)方中草藥的灌胃。根據(jù)之前研究復(fù)方中草藥對抑郁動物模型治療效果最佳的使用劑量[22]確定該實(shí)驗(yàn)劑量為：組分Ⅰ 164.6 mg/(kg·d) 和組分Ⅱ 15.625 mg/(kg·d)。干預(yù)前，使用無菌水將中草藥粉末調(diào)至適當(dāng)濃度（組分Ⅰ：41.15 mg/mL，組分Ⅱ：7.82 mg/mL），保存于4 ℃冰箱備用。經(jīng)過8 周的復(fù)方中草藥干預(yù)后，將3 組小鼠進(jìn)行行為學(xué)測試初步檢驗(yàn)干預(yù)效果。并在末次中草藥灌胃24 h后收集各組小鼠糞便樣本，保存于?80 ℃冰箱，每組隨機(jī)挑選三只小鼠糞便樣本用于16S rRNA基因高通量測序。

1.2.3 行為學(xué)實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)方法[23?24]進(jìn)行行為學(xué)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，分別采用逃避潛伏期、穿越目標(biāo)平臺次數(shù)等指標(biāo)衡量小鼠認(rèn)知功能。水迷宮直徑120 cm，高50 cm，站臺直徑9 cm，高30 cm，水面高于站臺1 cm，水中加入適量白色食用色素，使小鼠看不到平臺及池底，水池溫度維持在22～24 ℃，攝像頭位于水池正上方，調(diào)整池面攝像頭，使其視野覆蓋整個水池，電腦系統(tǒng)設(shè)定游泳時間（80 s）和平臺上停留時間（15 s），選擇小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ剑{(diào)整紅線圓圈使之分別準(zhǔn)確框定水池及平臺范圍，向水池內(nèi)注入自來水，為避免環(huán)境對小鼠的判斷產(chǎn)生干擾，調(diào)整燈光以免水面反射，四周墻壁杜絕掛物，室內(nèi)務(wù)必保持安靜。實(shí)驗(yàn)主要分為兩部分：一是定向航行實(shí)驗(yàn)，即設(shè)置平臺，每天灌胃后1 h內(nèi)進(jìn)行，每只小鼠面對池壁投入水中，記錄小鼠自入水到穩(wěn)定爬上平臺所需時間（即逃避潛伏期）。小鼠若能在80 s內(nèi)爬上站臺并穩(wěn)定站立15 s，記錄實(shí)用時間；若入水后80 s內(nèi)未能找到站臺并站立15 s，記錄80 s，可將動物引導(dǎo)上站臺穩(wěn)定站立15 s后拿下來，休息30～60 s再進(jìn)行下一次訓(xùn)練，共訓(xùn)練5 d，第6 d記錄逃避潛伏期；二是空間探索實(shí)驗(yàn)，即撤除站臺，觀察小鼠在一定時間（30 s）內(nèi)穿越原站臺次數(shù)，從第7 d開始，進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，記錄小鼠站臺穿越次數(shù)。

1.2.4 腸道菌群16S rRNA V4～V5 區(qū)高通量測序首先，對糞便前處理，采用QIAmp DNA Stool Mini Kit基因組提取試劑盒提取糞便細(xì)菌基因組；其次，對糞便細(xì)菌16S rRNA的V4～V5 區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增；然后將樣品委托給上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行建庫、測序；最后，基于有效測序數(shù)據(jù)進(jìn)行OTUs（Operational Taxonomic Units）聚類和物種分類分析。對OTUs聚類結(jié)果進(jìn)行Alpha多樣性（Shannon和Chao1 指數(shù)）和Beta多樣性分析。其中Beta多樣性分析通過基于Bray_curtis距離矩陣的PCoA直觀展示各樣品間差異大小。為進(jìn)一步挖掘各組間腸道微生物差異，選用單因素方差分析（one-way analysis analysis of variance,ANOVA）對各組物種進(jìn)行差異統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。最后基于PICRUSt 2 軟件通過 KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫比對，對腸道微生物功能進(jìn)行預(yù)測以及差異統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

選用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件對行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和糞便差異物種進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），P<0.05 認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)方中草藥干預(yù)后AD模型小鼠行為學(xué)的變化

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)反映出小鼠的認(rèn)知功能比變化，主要評價指標(biāo)包括逃避潛伏期和穿越目標(biāo)平臺次數(shù)；逃避潛伏期短，穿越目標(biāo)平臺次數(shù)多說明小鼠認(rèn)知能力強(qiáng)，反之則弱。如表1 所示，經(jīng)過8 周的復(fù)方中草藥干預(yù)后，CCHM組小鼠相比于AD組小鼠其逃避潛伏期縮短（P<0.05），穿越平臺次數(shù)顯著增加（P<0.05），并且結(jié)果接近于WT組，表明該復(fù)方中草藥能提高阿爾茲海默癥模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。綜上可推測，復(fù)方中草藥對阿爾茲海默癥癥狀的改善有一定的推動作用。

表1 各組小鼠行為學(xué)結(jié)果（）Table 1 Behavioral results of mice in each group ()

表1 各組小鼠行為學(xué)結(jié)果（）Table 1 Behavioral results of mice in each group ()

注：*表示與AD組相比差異顯著，*P<0.05;WT:野生型對照;AD:阿爾茲海默癥;CCHM:復(fù)方中草藥；圖4、圖6同。

2.2 復(fù)方中草藥對腸道菌群的影響

2.2.1 復(fù)方中草藥干預(yù)對腸道糞便菌群多樣性的影響 Alpha多樣性的大小決定了微生物菌群的豐富度和均勻性。Chao1 指數(shù)是豐富度估計(jì)量；而Shannon指數(shù)是計(jì)算菌群多樣性；包含物種間個體分配的均勻性以及物種數(shù)兩部分。指數(shù)值越大，代表群落豐富度與多樣性程度越高。如圖1 所示，相比于WT組，AD組Shannon與Chao1 指數(shù)顯著降低（P<0.05），表明AD組Alpha多樣性更低，但經(jīng)8 周的復(fù)方中草藥干預(yù)后菌群Alpha多樣性顯著升高（P<0.05）。與Strati等[25]的研究結(jié)果一致，表明健康組微生物的多樣性和豐富度都較高，并且復(fù)方中草藥的干預(yù)可以提高腸道物種的豐富度和多樣性。

圖1 各組糞便樣品物種豐富度與多樣性Fig.1 Species richness and diversity of fecal samples in each group

2.2.2 復(fù)方中草藥對腸道菌群結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)作用 進(jìn)一步通過PCoA直觀展示各個樣品間的差異大小，PCoA是一種研究數(shù)據(jù)相似性或者差異性的可視化方法，如果兩個樣品距離較近，則表示這兩個樣品的物種組成較相近。基于Bray_curtis距離矩陣的PCoA可以直觀看出三組間糞便菌群結(jié)構(gòu)不同，AD組和WT組菌群結(jié)構(gòu)存在差異；經(jīng)8 周復(fù)方中草藥干預(yù)后，CCHM組糞便菌群結(jié)構(gòu)偏離AD組，并接近于WT組（圖2）。這說明AD模型小鼠菌群結(jié)構(gòu)異于正常小鼠的菌群結(jié)構(gòu)，而復(fù)方中草藥干預(yù)可以改善AD模型小鼠菌群結(jié)構(gòu)。

圖2 基于OTU水平的β-多樣性分析Fig.2 Analysis of β-diversity on the OTU level

2.2.3 復(fù)方中草藥干預(yù)后腸道優(yōu)勢物種的變化 如圖3 所示，各組小鼠腸道優(yōu)勢OTU主要屬于：擬桿菌目S24-7 菌科（Bacteroidales_S24-7_group：OTU107、OTU237、OTU86、OTU18、OTU39、OTU215、OTU125）、毛螺菌科（Lachnospiraceae：OTU75、OTU168、OTU99、OTU377、OTU332、OTU311）、理研菌科（Rikenellaceae：OTU24）、脫硫弧菌屬（Desulfovibrio：OTU265）、Marvinbryantia（OTU318）、布勞特氏菌屬（Blautia：OTU81、OTU206）、乳酸菌屬（Lactobacillus：OTU391）、別樣桿菌屬（Alistipes：OTU361）、螺桿菌屬（Helicobacter：OTU399）、不動桿菌屬（Acinetobacter：OTU306）、擬普雷沃菌屬（Alloprevotella：OTU241）、乳梭菌屬（Lachnoclostridium：OTU363）、Erysipelatoclostridium（OTU62）。相比于WT組，AD組中某些優(yōu)勢OTU相對豐度發(fā)生變化，如OTU107、OTU124、OTU265 和OTU18 等，復(fù)方中草藥干預(yù)后群落OTU得到了調(diào)整且趨近于WT組，該結(jié)果與菌群的Alpha及Beta多樣性分析結(jié)果相一致。而通過單因素方差分析發(fā)現(xiàn)復(fù)方中草藥對AD模型小鼠糞便菌群中的優(yōu)勢OTU沒有顯著影響。

圖3 各組大鼠腸道菌群OTU水平相對豐度Fig.3 Relative abundance of dominant OTUs in microbial communities from different groups

2.2.4 復(fù)方中草藥干預(yù)后腸道特定微生物豐度的變化 為進(jìn)一步探究各組間物種的差異，進(jìn)行了OTU水平單因素方差分析，結(jié)果如圖4 所示，相比于WT組，AD組中OTU345、OTU380（Lachnospiraceae）、OTU22（Enterorhabdus）、OTU374（Roseburia）、OTU401（Enterorhabdus）、OTU264（Bacteroidales_S24-7_group）相對豐度顯著降低（P<0.05），經(jīng)復(fù)方中草藥干預(yù)后豐度增加，其中OTU345、OTU380 和OTU264 達(dá)到顯著性水平（P<0.05）。此外，通過對三組小鼠腸道菌群科水平進(jìn)行分析，同樣發(fā)現(xiàn)相比于WT組Lachnospiraceae相對豐度在AD組中明顯降低，而復(fù)方中草藥干預(yù)后豐度顯著增加（圖5A、B）。之前研究結(jié)果表明相比于健康人群，阿爾茲海默癥患者腸道菌群中Lachnos piraceae豐度降低[26]。Lachnospiraceae具有強(qiáng)大的產(chǎn)丁酸鹽能力[27]，丁酸鹽作為一種多功能分子，可保護(hù)神經(jīng)并改善腦健康。在創(chuàng)傷性腦損傷小鼠模型中，向腹膜內(nèi)注射丁酸鹽能夠減輕神經(jīng)功能缺損、腦水腫、神經(jīng)元改變和血腦屏障損傷，從而達(dá)到神經(jīng)保護(hù)作用[28]。在小鼠的AD模型中，丁酸鹽對學(xué)習(xí)和記憶有顯著改善，并使得學(xué)習(xí)相關(guān)的基因表達(dá)增加[29?30]。在CCHM組中顯著增加的OTU264 屬于Bacteroidales_S24-7_group，該菌科豐度在模型組中降低可貢獻(xiàn)擬桿菌門豐度降低，進(jìn)而導(dǎo)致厚壁菌門與擬桿菌門比例失調(diào)（圖5C），該比例失調(diào)與神經(jīng)性疾病的發(fā)生存在著重要聯(lián)系[31]。因此由以上結(jié)果可推斷，復(fù)方中草藥可能通過調(diào)節(jié)特定物種的豐度來改善AD模型小鼠認(rèn)知功能障礙。

圖4 三組小鼠基于OTU水平的相對豐度比較Fig.4 Comparison of relative abundance at the OTU level between four groups

圖5 三組小鼠糞便微生物相對豐度比較Fig.5 Comparison of relative abundance of fecal microorganisms among three groups of mice

2.2.5 復(fù)方中草藥干預(yù)后腸道特定微生物功能豐度的變化 基于PICRUSt2 軟件將每個OTU對應(yīng)的Greengene ID與KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）功能數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，獲得281 個預(yù)測功能，利用單因素方差分析對不同組功能豐度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，P值小于0.05 認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)分析得到10 個具有顯著差異的功能（圖6）。相比于WT組，組氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、煙酸及煙酰胺代謝、維生素B6代謝、氧化磷酸化作用、脂肪酸代謝、生物素代謝、脂肪酸生物合成等在AD模型組中顯著上升，而復(fù)方中草藥的干預(yù)可以減少這些功能的豐度。其中在AD模型組中氨基酸代謝的差異與Zheng等[32]的精神疾病小鼠腸道微生物氨基酸代謝紊亂的結(jié)論相一致。因此由結(jié)果可知，AD模型小鼠的腸道微生物功能與WT組差異較大，而通過復(fù)方中草藥的干預(yù)可以調(diào)節(jié)腸道菌群組成結(jié)構(gòu)，進(jìn)而緩解菌群代謝功能上的紊亂。

圖6 三組小鼠腸道微生物顯著差異的功能比較Fig.6 Comparison of significantly different gut microbial functions among three groups

3 結(jié)論

以逍遙散為基礎(chǔ)的復(fù)方中草藥可以改善APP/PS-1 雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠認(rèn)知功能障礙，且能調(diào)節(jié)腸道菌群組成、結(jié)構(gòu)及特定物種的豐度，如復(fù)方中草藥顯著提高了OTU345、OTU380 和OTU264的豐度（P<0.05），其中OTU345、OTU380 注釋到可產(chǎn)生丁酸鹽的毛螺菌科（Lachnospiraceae）。另外還能一定程度上緩解由AD引起的腸道微生物功能紊亂。由此說明復(fù)方中草藥可通過調(diào)節(jié)腸道菌群的結(jié)構(gòu)、組成和功能，緩解AD癥狀，進(jìn)一步為其使用提供了理論依據(jù)。