黃芪對2 型糖尿病大鼠堿性磷酸酶與炎癥反應的影響

王語聰，謝智鑫，張學艷，楊秋萍，韓建春,

（1.東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱 150030；2.黑龍江省綠色食品科學研究院，黑龍江哈爾濱 150028；3.東北農業大學醫院，黑龍江哈爾濱 150030）

在我國2 型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM）發病率呈現逐年遞增趨勢[1]，目前糖尿病的治療方法主要包括口服抗糖尿病藥物和胰島素。然而，連續使用這些藥物會導致胰島素抵抗和副作用，對糖尿病患者有效、無毒和價格友好的藥物的需求迫切。近年研究表明，糖尿病特征之一就是炎性反應，這與脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）增多有關。大量LPS進入血液循環后誘發炎癥因子釋放，進而引起炎癥失衡，導致胰島素抵抗（Insulin Resistance，IR）和最終誘發2 型糖尿病，現已證明此作用為“代謝性內毒素血癥”[2]。腸道堿性磷酸酶（Intestinal alkaline phosphatase，IAP）可以通過對LPS進行去磷酸化作用來保護細胞[3]，從而降低炎癥發生。此外，Bates等[4]探究LPS和IAP之間控制腸道炎癥水平的動態平衡反饋機制，研究表明LPS通過激活兩條不同的途徑誘導炎癥（即NFkB和LPS依賴的TNF-a釋放，后者通過TNF受體起作用）上調IAP基因轉錄的表達，IAP使LPS去磷酸化。去磷酸化的LPS不再能夠觸發TLR4 刺激，甚至可能阻斷該受體的結合。當刺激加大后炎癥相關基因的上調導致炎癥和細菌跨粘膜通道的增加，細胞內IAP可阻止NFkB途徑的兩個關鍵蛋白磷酸化。總之，IAP通過在兩個水平下調NFkB途徑來控制炎癥：通過減少LPS對TLR4 的刺激和通過阻止NFkB轉位到細胞核。因此，IAP與LPS呈負相關且對炎癥反應具有控制作用。

黃芪（Astragalus）作為藥食同源植物，被廣泛應用于臨床領域。黃芪屬于豆科草本植物類，含有豐富生物活性物質[5]，如黃酮類、苷類、糖類等。研究表明，黃芪在糖尿病中主要作用是使體內蛋白質合成增多、減少蛋白流出和加快胰島素分泌[6]。例如，Liu等[7]研究通過提取名為AERP的新型黃芪多糖，通過對db/db糖尿病模型小鼠研究表明能夠降低體內血糖的作用，進而證明黃芪能夠降低糖尿病血糖。翁孝剛等[8]在研究中表明脂聯素是與胰島素敏感有一定相關性的指標，0.1 g/L黃芪對3T3-L1 脂肪細胞脂聯素及mRNA表達水平影響最為顯著，說明黃芪對其有促進作用，推測黃芪可以影響胰島素抵抗。此外，費煜暢等[9]研究發現，黃芪多糖能夠通過影響THP-1 衍生巨噬細胞中產生炎癥因子[腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-12（IL-12）和白介素-10（IL-10）]，從而調控炎癥因子表達水平，最終增強細胞免疫作用，抑制腫瘤生長。

上述研究已指出黃芪具有降低血壓、血糖和抗炎等活性，但黃芪作為一種藥食同源的植物，直接食用能否促進IAP活性及在糖尿病模型中IAP、LPS和炎癥反應三者之間的關系至今仍不清楚。因此，本實驗以T2DM大鼠為模型，通過灌胃黃芪，檢測大鼠體質量變化和血糖濃度變化、糞便中IAP活力和LPS濃度，以及采用MSD多因子檢測手段來探究血清中炎癥因子水平[白介素-6（IL-6）、TNF-α、γ干擾素（IFN-γ）、白細胞介素-1（IL-1β）、生長調節致癌基因α（KC/GRO）、白介素-4（IL-4）、白介素-5（IL-5）、白介素-10（IL-10）、白介素-13（IL-13）]的變化，探究黃芪對糖尿病大鼠糞便中IAP和LPS的變化和血清中炎癥反應的影響，為黃芪在功能性食品開發利用提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

SPF級別SD雄性大鼠（150±20 ）g（合格證：No.1103241911038497）北京斯貝福生物有限公司；黃芪顆粒 南京同仁堂藥業采用清水煎煮，制成濃縮液，進行灌胃用藥；鏈脲佐菌素（STZ）美國Sigma公司；堿性磷酸酶試劑盒型號P0321 碧云天生物技術有限責任公司；內毒素檢測試劑盒型號EC80545S廈門試劑生物科技責任有限公司；Proinflammatory Panel 2（rat）Kits型號K15059DMeso Scale Diagnostics LLC公司；AIN-93M標準飼料（NMF，總熱能3601 kCal/kg，10%的能量為脂肪和14.1%的能量為蛋白質）中國營養動物飼料高科技有限公司；高糖高脂飼料（1.5%膽固醇、0.25%膽酸鈉、10%豬油、5%蔗糖、83.25%標準飼料）中國營養動物飼料高科技有限公司

HERAEUS Multifuge X3R離心機 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；1300 MESO? QuickPlex SQ 120 Meso Scale Diagnostics型MULTI‐ARRAY、MULTI‐SPOT?微孔板、MSD讀板機 LLC公司；I14698I血糖測定儀 強生醫療器械有限公司

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組及干預 將大鼠飼養于動物籠中，并保持50%±15%濕度，（22±2）℃溫度和晝夜12 h條件下單籠飼養。所有的試驗步驟遵循試驗動物護理以及動物協議，由西安交通大學動物倫理委員會批準[10]。在適應性喂養后，開始建立2 型糖尿病大鼠模型。除正常對照組外，其余組均高糖高脂飼料喂養4 周。將模型組和黃芪劑量組給予30 mg/kg STZ腹腔注射（禁食12 h），繼續喂養高糖高脂飼料；注射后第3 d和第7 d（禁食12 h），檢測空腹血糖值，選取空腹血糖值≥11.1 mmol/L的大鼠為造模成功的大鼠[11?12]。在對STZ粉劑進行計算時，以30 mg/kg為計量標準，溶解于新鮮的檸檬酸鈉緩沖液中（0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液，pH4.3）。為保證其特性，應現用現配，并避光保存。

將大鼠分成4 組（n=10）并投喂標準飲食及高糖高脂飼料。第1 組正常對照組：未經處理，每日給予標準飼料飼喂并灌胃20 mL/kg超純水；第2 組模型組：建模成功后喂飼高糖高脂飼料并灌胃20 mL/kg超純水；第3 組黃芪低劑量組：建模成功后喂飼高糖高脂飼料并每天灌胃20 mL/kg黃芪劑量為0.25 g/kg溶劑；第4 組黃芪高劑量組：建模成功后喂飼高糖高脂飼料并每天灌胃20 mL/kg黃芪劑量為0.5 g/kg溶劑。依據文獻報道[13]，選擇此黃芪低、高劑量。試驗期間小鼠自由采食和飲水，每天早上八點定時灌胃，在建模成功后第4 周處死并進行炎癥因子指標檢測。

試驗開始后采取2 粒大鼠糞便于EP管中放在?20 ℃儲存。用于檢測糞便中堿性磷酸酶和細菌內毒素含量。

1.2.3 大鼠體重和血糖值檢測 開始條件喂養后，每周進行尾靜脈采血用血糖儀測定空腹血糖（Fasting blood glucose，FBG），并稱量體重。

1.2.4 細菌內毒素（脂多糖LPS）測定 取少量糞便，加入一定比例細菌內毒素檢驗用水（1:10 g/mL），迅速離心1 min（3000×g）收集上清液，利用試管定量顯色基質法檢測細菌內毒素濃度[14]。

1.2.5 堿性磷酸酶測定 取少量新鮮糞便，以1 mg糞便中加入50 μL PBS溶液比例進行稀釋。用旋渦法制備糞便勻漿懸液，通過離心（20 min，10000×g）收集含IAP上清液，并根據堿性磷酸酶試劑盒說明書測定IAP活性。

1.2.6 MSD多因子檢測 炎癥因子含量利用MSD電化學發光（ECLA）檢測技術，以SULFO‐TAGTM標記物，在MULTI‐ARRAY和MULTI‐SPOT?微孔板電極表面通電后，電化學作用激發SULFO‐TAGTM標記物發出強光，檢測炎癥因子含量[15]。

1.3 數據分析

本研究通過Excel、Origin 2017、IBM SPSS Statistics 20 對數據進行整理分析。試驗數據均表示為平均值±標準誤差（Mean±SEM），采用t檢驗進行統計分析，P<0.05 認為差異具有統計學意義，即差異顯著，P<0.01 即極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 大鼠血糖變化

如表1 所示，建模前血糖無顯著差異（P>0.05），建模成功后的7 和14 d時，與正常對照組相比，模型組血糖有極顯著升高（P<0.01）；與模型組相比，黃芪劑量組均無顯著差異（P>0.05）。在21 d時，與正常對照組相比，模型組有極顯著差異（P<0.01）；與模型組相比，黃芪低劑量組無顯著差異（P>0.05），高劑量組顯著降低（P<0.05）。在28 d時，與正常對照組相比，模型組極顯著上升（P<0.01）；與模型組相比，黃芪劑量組均顯著降低（P<0.05）。

表1 黃芪對2 型糖尿病大鼠空腹血糖的影響（,n=10）Table 1 Effect of Astragalus powder on fasting blood glucose in type 2 diabetic rats (,n=10)

表1 黃芪對2 型糖尿病大鼠空腹血糖的影響（,n=10）Table 1 Effect of Astragalus powder on fasting blood glucose in type 2 diabetic rats (,n=10)

注：*表示與正常對照組相比，差異顯著P<0.05；**表示與正常對照組相比，差異極顯著P<0.01；#表示與模型對照組相比，差異顯著P<0.05：##表示與模型對照組相比，差異極顯著P<0.01；表2，圖2～圖4同。

血糖是診斷T2DM最重要標準，血糖高低標志著T2DM病情改善情況。有研究表明，黃芪主要通過加強胰島素敏感性，并改善IR狀況方式降低血糖，其中黃芪中多種活性成分包括多糖、甲苷等有降糖作用[16]。本實驗研究結果表明，黃芪使T2DM大鼠降糖效果明顯，與模型組相比差異顯著（P<0.05）。說明黃芪對T2DM大鼠有輔助降糖作用，高劑量組降糖效果更好，原因可能是黃芪中活性物質的表面結構中羥基和氨基能夠形成絡合物，這種絡合物對STZ致高血糖小鼠模型有降糖作用[17]，因而能夠有效抑制T2DM。

2.2 大鼠體質量變化

如圖1 所示，建模完成后第4 周，與正常對照組相比，模型組體質量顯著下降（P<0.05）；與模型組相比，黃芪劑量組差異不顯著（P>0.05）。

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圖1 各組大鼠體質量隨干預時間變化（,n=10）Fig.1 Changes in body mass of rats in each group with intervention time（,n=10）

整個實驗過程中，正常對照組活動正常，精神狀態良好，色澤光亮；模型組不活潑、精神狀態差，被毛無光澤。黃芪組精神好轉，反應敏感度加大，頹廢狀態有所改善，活動增多，說明黃芪可以緩解T2DM帶給大鼠的不良影響。結果表明，建模成功后，正常對照組體重有所增加，而模型組和黃芪劑量組喂飼高糖高脂飼料后，體重出現下降趨勢，原因可能是高劑量STZ與高熱量飲食聯合[18]，導致胰島β細胞發生壞死，并致胰島素分泌發生不足，進而使體內糖代謝絮亂，發生胰島素抵抗，大鼠為體內脂肪和蛋白質提供能量[19]。

2.3 糞便中IAP活性和LPS濃度變化

如表2 所示，與正常對照組相比，模型組LPS濃度顯著上升（P<0.05）；與模型組相比，黃芪劑量組LPS顯著降低（P<0.05）。在IAP方面，與正常對照組比，模型組極顯著降低（P<0.01）；與模型組相比，黃芪劑量組均極顯著升高（P<0.01）。

表2 黃芪對2 型糖尿病大鼠糞便中IAP和LPS影響（,n=10）Table 2 Effect of Astragalus on IAP and LPS in fecal of type 2 diabetic rats（,n=10）

表2 黃芪對2 型糖尿病大鼠糞便中IAP和LPS影響（,n=10）Table 2 Effect of Astragalus on IAP and LPS in fecal of type 2 diabetic rats（,n=10）

IAP是一種腸道刷狀邊界酶，其僅在近端小腸絨毛相關腸細胞中表達，可以作為腸道粘膜防御因子，維持腸道內環境穩定，保護宿主免受腸道炎癥損傷。IAP可以降解LPS，降低其毒性，其原因為IAP使LPS脫磷酸，失去破壞性，從而解毒[20]。有研究表明正常人糞便IAP活性要比T2DM患者活性高，糞便中IAP每降低25 μ/g，糖尿病風險增加35%[21]。LPS是革蘭氏陰性菌的組成部分，當腸道中LPS濃度過高時，誘發腸道炎癥發生。有證據表明，T2DM有利于內毒素（特別是脂多糖（LPS））在腸屏障中易位，導致血液中內毒素濃度輕微升高[22]。Poelstra等[23]首次發現LPS是IAP的作用底物，因此提出IAP可以降解LPS的假說。Bates等[24]研究結果表明，腸道中IAP和LPS存在負相關關系，當腸腔中IAP濃度增加時，對LPS作用增加，LPS所帶毒性就得到減少，降低腸道炎癥。實驗結果表明，黃芪增加T2DM大鼠糞便IAP活性和降低LPS濃度。說明黃芪能夠改善糖尿病大鼠腸道中IAP活性并降低LPS的濃度。

2.4 血清中炎癥因子含量測定

2.4.1 促炎因子含量變化 如圖2 所示，與正常對照組相比，模型組IL-6 濃度、IL-1β濃度、TNF-α濃度和IFN-γ濃度均顯著升高（P<0.05 或P<0.01）；與模型組相比，黃芪劑量組IL-6、IL-1β、TNF-α和IFNγ均顯著降低（P<0.05 或P<0.01）。

圖2 黃芪對小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α 和IFN-γ 濃度（,n=10）Fig.2 Effect of Astragalus on the concentration of IL-6,IL-1β,TNF-α and IFN-γ in mouse serum（,n=10）

T2DM主要體現胰島素抵抗及胰島素分泌不足，已有研究表明，腸道慢性炎癥在T2DM發生和發展中發揮重要作用，腸道粘膜免疫發生絮亂，就會引起腸道炎癥發生[25]。IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ可以作為炎癥反應調節因子，在炎癥中發揮中心作用，當免疫因子被激活時釋放，機體中其含量增加，引起損傷。有研究表明T2DM高血糖可以促進TNFα濃度升高，過多加速胰島細胞破壞；高脂喂養的小鼠中腸道中IL-6 分泌增加，TNF-α表達升高[26]。張晶[27]在探討BMDM細胞中黃芪對其中炎癥因子影響中，通過黃芪誘導，細胞中IL-6、TNF-α表達受到抑制。鄭洋等[28]在急性胰腺炎大鼠中，經過黃芪注射液治療后發現，大鼠腸道屏障功能得到保護，炎癥因子IL-6、TNF-α分泌降低；朱麗坤[29]在db/db小鼠腎臟炎癥因子中，同樣發現黃芪對IL-1β、TNFα起到了抑制作用。本試驗結果表示，黃芪劑量組能夠顯著降低IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ濃度（P<0.05），其可能原因為促炎因子受到胰島素抵抗以后分泌速度加快，導致胰島素細胞凋亡速度加快，因此能夠證明，黃芪可降低相關炎癥因子濃度，從而緩解炎癥，進而緩解T2DM。

2.4.2 抗炎因子含量變化 如圖3 所示，與正常對照組相比，模型組IL-4、IL-5、IL-10 和IL-13 均顯著下降（P<0.05 或P<0.01）；與模型組相比，黃芪劑量組IL-4、IL-5、IL-10 和IL-13 均顯著降低（P<0.05 或P<0.01）。

圖3 黃芪對小鼠血清IL-4、IL-5、IL-10 和IL-13 濃度（,n=10）Fig.3 Effect of Astragalus on the concentration of IL-4,IL-5,IL-10 and IL-13 in mouse serum（,n=10）

IL-4 典型抗炎因子，在Th2 細胞中都具有代表性炎癥因子，可以抑制炎癥因子分泌，包括IL-6、TNF-α等，IL-5 同IL-4 一樣在Th2 細胞中發揮重要作用，可以緩解由嗜酸性粒細胞誘導炎癥效應，Th2 細胞屬于抗炎細胞，起到重要抗炎作用，可以使Th1 介導炎癥受阻[30]；IL-10 是免疫調節因子，可以終止炎癥發生；IL-10 屬于抗炎因子，可以控制炎性反應發生，機體組織糖、脂肪代謝可以被IL-10 調節，起到T2DM發生預防作用。IL-13 可以使巨噬細胞活化受到抑制，減少炎癥因子分泌，可以同時抑制炎癥介質產生，又可以使B細胞增殖加快及分泌抗體，起到抗炎因子作用[31]。李金萍[32]探究在潰瘍性結腸炎大鼠中，黃芪多糖對其血清因子影響，與模型組相比IL-4 和IL-13 升高顯著，結果表明黃芪多糖升高了IL-4 和IL-13 含量，對IL-5 影響不明顯；宋厚盼等[33]研究表明黃芪建中湯對十二指腸潰瘍大鼠中血清IL-4、IL-10 含量升高，IL-13 含量下降明顯。本次實驗結果表明，與模型組相比，黃芪高劑量組中大鼠血清IL-4、IL-5、IL-10 濃度有極顯著差異（P<0.01）；黃芪高劑量組中IL-13 濃度出現差異顯著（P<0.05），其可能原因是黃芪刺激抗炎因子，使其表達量增加，從而抑制促炎因子的表達量，并升高抗炎因子濃度，緩解炎癥反應。

2.4.3 趨化因子含量變化 如圖4 表示，與正常對照組相比，模型組KC/GRO濃度極顯著升高（P<0.01）；與模型組相比，黃芪劑量組KC/GRO濃度均極顯著降低（P<0.01）。

圖4 黃芪對小鼠血清KC/GRO濃度（,n=10）Fig.4 Effect of Astragalus affects the serum KC/GRO concentration of mice（,n=10）

KC/GRO是趨化因子中的一種，推測其表達與細胞生長有關，與受體結合后可促進炎癥反應[34]。總體來說，由于攝入高脂肪食物會導致腸道中LPS的釋放，破壞腸道粘膜從而刺激炎癥因子的釋放[35]，然而，目前還沒有對趨化因子的數據支撐。因此，本實驗結果表明黃芪能夠有效降低糖尿病小鼠血清中KC/GRO，進而降低血清中促炎因子。其可能的原因是黃芪降低LPS及炎癥因子的濃度從而減少GRO的表達，進而有效改善T2DM。

3 結論

通過糖尿病模型大鼠實驗研究發現，黃芪可以維持血糖穩定，提高腸道中IAP活力，有效降低LPS濃度。通過大鼠血清中抗炎因子、促炎因子及趨化因子水平進一步驗證LPS可能引起的炎性反應。全面驗證了IAP與炎癥因子的關系，因此黃芪能夠有效改善T2DM的炎癥反應，其作用機制可能是通過調節腸道中IAP活力刺激LPS濃度的變化調控來實現的。有研究表明，IAP活性和相應的LPS去磷酸化能力在小鼠的糞便及腸道中存在，并且IAP在控制細菌成分引起的腸道炎癥和細菌通過腸道粘膜方面的體內作用是互補的[24]，因此未來需要進一步研究黃芪在腸道粘膜中IAP是如何調控參與改善機體炎癥，緩解T2DM的發展。