季銨鹽改性止血海綿的制備及其生物性能研究*

李紅梅，張素文，羅西友，尹弢，郈秀菊

(山東省藥學科學院 山東省醫用高分子材料重點實驗室，濟南 250101)

1 引 言

外科手術中快速有效地控制出血，降低創傷，防止細菌感染具有重要意義。傳統止血材料種類較多，但均存在一定的缺點，如對傷口處組織的粘附性差，不控制出血可能會導致嚴重的并發癥,并增加患者的死亡率，止血時間相對較長，可能會導致二次出血，容易產生病毒感染和保存期限較短等。

近年來，生物醫用材料的研究取得了很大進步，同時也加快了接觸止血材料的發展[1-4]。目前臨床應用的接觸止血材料主要為可吸收性止血材料[5-7]，包括以下幾種：

(1)可吸收性明膠海綿、膠原蛋白海綿、微纖維膠原蛋白粉[8-11]：它們來源于動物組織提取物，含異種蛋白，易引起過敏反應和發熱癥狀，人體吸收在4周以上，期間會增加感染率，影響傷口愈合，臨床局限性大。

(2)改性纖維素止血紗布：代表產品為強生公司的速即紗TM(SURGICEL)。正常的人體組織因缺乏代謝纖維素的酶導致吸收速度相對較慢，且產品呈酸性，臨床上可能引起局部的感染及影響局部組織愈合。

(3)微孔止血球[12]：代表產品有美國的AristaTM和山東賽克賽斯藥業科技有限公司的“瞬時”復合微孔多聚糖止血粉。生物相容性好，無過敏反應，不會感染動物源性疾病。但活動性出血時難附著。

鑒于此，本研究旨在開發一種快速止血兼具生物相容性和抗菌功能的安全[13-18]、有效的植物多糖手術止血材料。

2 材料和方法

2.1 原料試劑

季銨鹽改性淀粉聚合物(季銨鹽和淀粉的質量摩爾比為0.3∶1時的反應產物，其中季銨鹽是由環氧氯丙烷和N,N-二甲基辛基叔胺合成所得)，北京化工大學；甘油、聚山梨酸酯60，分析純，天津市大茂化學試劑廠。

2.2 儀器設備

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，DF-101S型，上海雷磁儀器廠；冷凍干燥機，FD-1A-50型，北京博醫康實驗儀器有限公司。

2.3 實驗方法

取季銨鹽改性淀粉聚合物8.0 g，甘油3.0 g，蒸餾水88 g，55℃水浴加熱溶解4 h，然后加入聚山梨酸酯601 g。物理發泡后經低溫冷凍干燥，得季銨鹽改性止血海綿。

2.4 吸水倍率測試

稱取季銨鹽改性止血海綿0.8 g[19]，置于潔凈干燥的培養皿中，稱重m1，加入適量去離子水，待海綿吸水飽和后，倒出多余水分，稱重m2，根據式(1)計算吸水倍率(A)：

A= (m2-m1)/0.8

(1)

2.5 吸水速率測試

稱取季銨鹽改性止血海綿0.2 g，加入水，開始計時，到樣品完全吸水停止計時，記錄時間(s)。

3 結果與討論

3.1 配方工藝研究[20-24]

按照季銨鹽改性淀粉聚合物和甘油的質量比分別為8∶1、8∶3、8∶5混合，加適量水，55℃水浴加熱溶解4 h，然后按照季銨鹽改性淀粉聚合物和聚山梨酸酯60的質量比分別為8∶0.3、8∶0.5、8∶1、8∶1.2的比例加入聚山梨酸酯60，物理發泡后經低溫冷凍干燥，制得季銨鹽改性止血海綿，測試不同配方的吸水倍率和吸水速率，結果見表1，最優配方為季銨鹽改性淀粉聚合物∶甘油∶聚山梨酸酯60=8∶3∶1。

表1 季銨鹽改性止血海綿的吸水倍率和吸水速率Table 1 Water absorption ratio and water absorption rate of sponge

3.2 冷凍干燥成型工藝研究

季銨鹽改性淀粉止血海綿的冷凍干燥工藝中，冷凍溫度分別選擇-20℃、-38℃、-56℃和-66℃，冷凍時間分別選擇8、12、20、24 h，冷凍干燥結束后觀察海綿的狀態并測試其吸水倍率，結果見表2。冷凍干燥的最優工藝為冷凍溫度-56℃、冷凍時間20 h。

表2 冷凍條件對海綿性能的影響

3.3 抑菌性試驗[25]研究

根據季銨鹽和淀粉的不同質量摩爾比所得的醚化產物(北京化工大學提供)進行常溫和加速3月的抑菌性研究，按照GB 15979-2002 中附錄C4的方法進行。篩選出抑菌性良好的工藝條件，結果見表3。當季銨鹽和淀粉的質量摩爾比大于0.3∶1時，其對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌的常溫和加速3月的樣品抑菌率大于90%，說明抑菌率及穩定性良好。

表3 抑菌性研究

3.4 季銨鹽改性止血海綿的大鼠肝臟止血試驗[26-27]和體內降解試驗

將大鼠按性別、體重隨機分為2組，分別為季銨鹽改性止血海綿組、膠原蛋白海綿組，每組10只大鼠，將大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉約40 mg/kg，麻醉后仰臥固定，逐層開腹，游離并暴露肝臟左葉，用組織鉗在肝臟左葉中間位置切取下一塊肝組織(5×3×2 mm)，造成敞開型傷口，自由出血5 s后，使用相應的止血海綿，記錄時間，同時用10 g砝碼壓20 s，取下觀察30 s，記錄止血時間。手術中，使用稱重的無菌紗布收集用藥后所出的血液，計算術中總的出血量和止血時間，見表4。術后2、4周，分別將5只大鼠(雌雄均有)麻醉剖腹，觀察各大鼠創面的血腫、腹腔粘連和季銨鹽改性止血海綿的降解情況并拍照記錄。

表4 大鼠肝臟止血實驗結果

由表4可知，本研究制備的季銨鹽改性止血海綿是一種快速有效的止血敷料。

同時觀察得知，2周植入處含未降解的均質淡染的樣品，組織未見壞死、水腫、炎細胞浸潤等組織病理學變化。剛果紅染色結果顯示，4周后植入部位無殘存的季銨鹽改性止血材料碎片，4周后的組織切片見圖1。

圖1 組織切片圖

3.5 細胞毒性試驗

細胞毒性試驗[28-29]是用體外細胞培養方法進行毒理學風險評價。實驗共設空白對照組、陰性對照組、陽性對照組與實驗組，分別放于培養著L929小鼠成纖維細胞的細胞培養板孔內，在5%CO2、37℃細胞培養箱中培養，分別于24 h和48 h后顯微鏡下觀察實驗組、陰性對照組、陽性對照組及空白對照組培養后的細胞形態學改變，48 h后用MTT法測定各供試品組(樣品組、陰性對照組、陽性對照組)相對于空白對照組的細胞相對增殖率。

結果表明，在本試驗條件下，基于MTT定量檢測法，未改性淀粉海綿的細胞相對增殖率為83%，細胞毒性分級為1級；季銨鹽改性淀粉止血海綿的細胞相對增殖率為200%，細胞毒性分級為4級。說明季銨鹽改性淀粉止血海綿有抑菌性，這也與其抑菌性能試驗結果相對應。

3.6 皮內刺激試驗報告

采用家兔進行皮內反應試驗[30]，以評價試驗樣品在試驗條件下產生剌激反應的潛能。采用0.9%氯化鈉注射液(SC)和棉籽油(CSO)對試驗樣品進行浸提，并同理制備不加試驗樣品的空白對照液。在家兔脊椎兩側皮內注射試驗液及空白對照液，于注射后(24±2)、(48±2)、(72±2) h，對注射部位紅斑和水腫進行評分，并計算試驗樣品和對應空白對照的皮內反應最終記分。

結果顯示，在本試驗條件下，季銨鹽改性淀粉止血海綿經浸提后的試驗液在家兔皮內反應最終記分均不大于1.0，符合試驗要求。

3.7 皮膚致敏試驗報告

對試驗樣品的0.9%氯化鈉注射液(SC)和棉籽油(CSO)試驗液進行了皮膚致敏[17]最大劑量試驗，以評價試驗樣品在試驗條件下使豚鼠產生皮膚致敏反應的潛能。按Magnusson和Kligman分級標準進行描述并分級。對照組動物同法操作。

結果顯示，在本試驗條件下，季銨鹽改性淀粉止血海綿經浸提后的試驗液未導致豚鼠出現皮膚致敏反應。

4 結論

本研究選用季銨鹽改性淀粉聚合物為原料，進行止血海綿的制備，季銨化修飾可以破壞細菌的細胞質膜，賦予了淀粉抗菌的性能，加速傷口血小板和紅細胞的聚集，快速止血。季銨鹽改性淀粉止血海綿工藝中最優配方為季銨鹽改性淀粉聚合物：甘油：聚山梨酸酯60=8∶3∶1。其冷凍干燥的最佳工藝為冷凍溫度為-56℃，冷凍時間為20 h。其中季銨鹽和淀粉的質量摩爾比為0.3∶1及以上時(由北京化工大學提供)，其對金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌的抑菌率分別達99.98%以上和99.97%以上，抑菌性良好，且生物相容性好。大鼠止血試驗以及體內降解試驗表明季銨鹽改性止血海綿具有良好的止血性能，降解時間能夠滿足臨床上對于止血海綿的性能要求。綜上，本研究制備的季銨鹽改性止血海綿具有很好的臨床應用前景。