匹立尼酸對肝癌經(jīng)導(dǎo)管動脈栓塞術(shù)后癌旁肝組織氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的作用

楊培鈺 杜偉 李正亮 周舟 熊文翠

大理大學(xué)1臨床醫(yī)學(xué)院，2第一附屬醫(yī)院放射科（云南大理671000）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一種常見的高侵襲性惡性腫瘤，是全球第五大常見癌癥和第二大致死癌癥［1］，由于肝癌的發(fā)病隱匿，大多數(shù)患者在確診時已處于中晚期，無法通過肝切除術(shù)、射頻消融或肝移植治療，經(jīng)導(dǎo)管動脈栓塞術(shù)（TAE）成為了不能進(jìn)行手術(shù)切除和肝臟移植患者的主要治療手段［2-4］。由于栓塞劑的非選擇性，使其無法避免的擴(kuò)散到癌旁正常肝組織，導(dǎo)致相應(yīng)供血動脈栓塞，而且肝臟有一半的氧供來自肝動脈，導(dǎo)致癌旁肝組織缺血/再灌注損傷［5］，其中大量活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的釋放所致的氧化應(yīng)激是主要因素，其次是炎癥反應(yīng)和細(xì)胞水腫，引起正常肝組織壞死、凋亡［6-7］，而且80%的HCC 患者合并有肝硬化、門脈高壓的基礎(chǔ)病變，以致TAE 術(shù)后癌旁正常肝組織肝功能損傷更為嚴(yán)重，增加了TAE 術(shù)后發(fā)生急性肝衰竭的概率［8］，嚴(yán)重影響了患者預(yù)后，因此如何緩解TAE 術(shù)后肝功能不同程度下降成為了臨床上改善患者預(yù)后的關(guān)鍵。筆者前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：兔VX2 肝癌模型經(jīng)TAE 術(shù)后，癌旁肝組織抗氧化酶系統(tǒng)減弱、NF-κB 介導(dǎo)的炎癥因子增加，引起氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致正常肝組織壞死凋亡增加，肝功能受損［9-10］。本次實驗是在前期研究基礎(chǔ)上從動物水平進(jìn)一步探討緩解TAE 術(shù)后肝功能下降的治療方法及其可能的機(jī)制。過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator activated receptors，PPARs）是核受體超家族、配體依賴的轉(zhuǎn)錄因子，包括PPAR-α、PPAR-β、PPAR-γ三種亞型，其中PPAR-α主要分布在代謝旺盛的器官，如肝臟、心臟、腎臟［11］。將PPARs 作為藥物治療靶點成為近年來的研究熱點，研究表明PPAR-α可以通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄來改善氧化應(yīng)激損傷，減少細(xì)胞壞死凋亡［12-13］，匹立尼酸是一種新型人工合成的PPAR-α激動劑，通過激活PPAR-α來發(fā)揮其調(diào)節(jié)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的作用。然而PPAR-α激動劑匹立尼酸對肝癌經(jīng)TAE 術(shù)后癌旁肝組織能否發(fā)揮其調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)的作用，來減輕氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，緩解TAE 術(shù)后肝功能降低，從而改善預(yù)后，其相關(guān)內(nèi)容國內(nèi)外鮮有報道，仍需進(jìn)一步探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物荷瘤兔2只（東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院惠贈），健康新西蘭大白兔80只［購于昆明楚商科技有限公司，許可證號SCXK（滇）K2018-0001］，體質(zhì)量2.5～3.5 kg，雌雄不限，普通飼料喂養(yǎng)。

1.2 主要試劑谷丙轉(zhuǎn)氨酶測試盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶測試盒（上海博耀生物科技有限公司）。兔（SOD、GSH-PX、CAT）ELISA 試劑盒（購于南京建成生物工程研究所有限公司），MDA測試盒（購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司）。TUNEL 試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司）。動物總RNA 快速提取試劑盒（捷瑞，GK3016），RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（美國Thermo 公司，K1622），F(xiàn)astStart Universal SYBR Master（瑞士ROCHE公司，04913850001），實時熒光定量PCR 儀（BIO-RAD，CFX96）?？雇枚梗绹鳥io Vision 公司）。

1.3 模型建立、分組及處理荷瘤兔傳代、瘤粒注射方式［10］成功建立兔VX2肝癌模型60只，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其隨機(jī)分為對照組（CON 組），TAE 組，聯(lián)合治療組（WT組），每組20只。CON組不作任何處理，TAE 組進(jìn)行TAE 手術(shù)治療［14］，WT 組在TAE 術(shù)前連續(xù)3 d 經(jīng)耳緣靜脈注入匹立尼酸3 mg/（kg·d）。兔VX2 肝癌模型建立及TAE 治療（圖1）。

圖1 兔VX2 肝癌模型及TAE 治療Fig.1 Rabbit VX2 liver cancer models and TAE treatment

1.4 肝功能檢測和癌旁肝組織樣本分離TAE 術(shù)后3 d 經(jīng)兔耳緣靜脈采集3 組實驗兔外周血（每只4 mL），測量肝功能指標(biāo)ALT、AST，具體操作嚴(yán)格按照ALT、AST 試劑盒使用說明進(jìn)行。隨后將實驗兔處死，取劍突下腹部正中偏左切口，剖出完整肝臟，于腫塊邊緣2 cm 以外分離出癌旁肝組織，液氮速凍，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、GSH-Px、CAT 和MAD的檢測取適量樣本制備各組癌旁肝組織勻漿，嚴(yán)格按照SOD、GSH-Px、CAT 和MAD 試劑盒使用說明進(jìn)行操作，分別測得各組SOD、GSH-Px、CAT和MAD 的吸光度值，計算得出各氧化應(yīng)激指標(biāo)活性、含量。

1.6 TUNEL 法檢測肝細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）具體操作步驟嚴(yán)格按TUNEL 試劑盒進(jìn)行，通過光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞核著色呈棕黃色或棕褐色的凋亡細(xì)胞。采取雙盲法觀察并計算細(xì)胞凋亡指數(shù)AI。

1.7 RT-qPCR檢測SOD1、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平取適量樣本制備各組癌旁肝組織勻漿，采用Trizol 法提取總mRNA，用微量分光光度計測得OD 值，計算出RAN 純度和濃度，嚴(yán)格按照試劑盒使用說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄、RT-qPCR 反應(yīng)，SOD1引物序列上下游分別為：5′-CACCATCCACTTCGAGCAGA-3′，3′-GTCACATTACCCAGGTCGCC-5′；Bcl-2 引物序列上下游分別為：5′-TGGACAAACCTGAGCCCTAAC-3′，3′-TCACTTTCTGCAGGCCAAGT-5′；Caspase-3 引物序列上下游分別為5′-CAGACACGGTGGAGCAGATC-3′，3′-AAGACTACCAAGCCGCTGAC-5′；以GAPDH 作為內(nèi)參，其引物序列上下游為5′-GCTGCTTTTAACTCTGGCAAAGT-3′，3′-TGATGGCCTTCCCGTTGATG-5′。反應(yīng)條件：95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，20 s；72 ℃，25 s；40 個循環(huán)；72 ℃，5 min。繪制溶解曲線，采用2-ΔΔCt法分析mRNA 的相對表達(dá)含量。

1.8 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測SOD1、Bcl-2、Caspase-3 蛋白表達(dá)Western blot 法檢測癌旁肝組織勻漿中SOD1、Bcl-2、Caspase-3 蛋白表達(dá)，β-actin 作為內(nèi)參，Ecl 顯色，曝光2～3 次，使用軟件分析測定條帶的灰度值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法利用GraphPad Prism 7.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用單因素分析和t檢驗對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝功能指標(biāo)ALT、AST 變化水平與CON 組比較，TAE 組ALT、AST 水平明顯增加；與TAE 組比較，WT 組ALT、AST 水平明顯減少；WT 組較對照組增多，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001，表1）。

表1 肝功能指標(biāo)ALT、AST 和凋亡指數(shù)AITab.1 Liver function（ALT，AST）and apoptosis index±s

表1 肝功能指標(biāo)ALT、AST 和凋亡指數(shù)AITab.1 Liver function（ALT，AST）and apoptosis index±s

注：ALT、AST、AI 各組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義

組別CON 組TAE 組WT 組F 值A(chǔ)LT（U/L）54.99±5.14 90.39±8.77 63.77±6.32 127.2 AST（U/L）45.24±6.82 100.50±6.43 74.10±6.02 369.8 AI（%）2.44±0.97 64.54±7.23 26.84±6.06 653.2

2.2 氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、GSH-Px、CAT 和MAD的活性和含量變化與CON 組比較，TAE 組SOD、GSH-Px、CAT 活性明顯降低，MAD 含量明顯增加（P＜0.001）；與TAE 組比較，聯(lián)合治療組SOD、GSH-Px、CAT 活性明顯升高，MAD 含量明顯減少（P＜0.001）；WT 組與對照組比較SOD 活性增加（P＜0.001），余GSH-Px、CAT、MDA 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖2）。

圖2 各組癌旁肝組織SOD、GSH-Px、CAT 活性變化（U/mgprot，n=20），MDA 含量變化（nmol/mgprot，n=20）Fig.2 Vitality of SOD，GSH-Px，CAT（U/mgprot，n=20）and levels of MDA（nmol/mgprot，n=20）

2.3 凋亡情況及AI與CON 組比較，TAE 組AI明顯增加；與TAE 組比較，WT 組AI 明顯減??；WT組AI 較對照組增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（表1、圖3）。

圖3 癌旁肝組織凋亡情況（×40）Fig.3 Apoptosis of liver tissue adjacent cancer（×40）

2.4 SOD1、Bcl-2、Caspase-3 mRNA 表達(dá)水平變化與CON 組比較，TAE 組SOD1、Bcl-2 mRNA 表達(dá)明顯下降，Caspase-3 mRNA 表達(dá)明顯上升（P＜0.001）；與TAE 組比較，WT 組SOD1、Bcl-2 mRNA表達(dá)明顯上升（P＜0.001）；與CON 組比較，WT 組SOD1、Bcl-2 表達(dá)均上升（P＜0.001），而Caspase-3與之相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.385 3，圖4）。

圖4 各組SOD1、Bcl-2、Caspase-3 mRNA 相對表達(dá)含量（n=20）Fig.4 SOD1，Bcl-2，Caspase-3 mRNA relative expression（n=20）

2.5 SOD1、Bcl-2、Caspase-3 蛋白表達(dá)水平變化與CON 組比較，TAE 組SOD1、Bcl-2 蛋白表達(dá)明顯下降，Caspase-3 蛋白表達(dá)明顯上升（P＜0.05）；與TAE組比較，WT組SOD1、Bcl-2 蛋白表達(dá)明顯上升，Caspase-3 蛋白表達(dá)明顯下降（P＜0.001）；WT 組與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001，圖5、6）。

圖5 各組癌旁肝組織相關(guān)蛋白Western-blot 結(jié)果（n=3）Fig.5 Western-blot of SOD1，Bcl-2，Caspase-3 protein（n=3）

3 討論

肝癌是一種高發(fā)惡性腫瘤，全世界每年新增肝癌患者60 萬例，超過50%的新發(fā)病例出現(xiàn)在我國［15］。肝癌患者早期癥狀不明顯，就診時多被診斷為肝癌晚期［16］，患者失去了手術(shù)切除和肝臟移植的機(jī)會，此時TAE 成為了肝癌治療的主要方式［17］。由于栓塞劑不可避免的進(jìn)入癌旁正常肝組織血管，引起肝臟缺血/再灌注損傷，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，細(xì)胞凋亡增多，而且大部分患者有肝硬化病史，TAE 術(shù)后患者肝功能受損更為嚴(yán)重，極大的影響了患者的預(yù)后。本次實驗探討PPAR-α激動劑匹立尼酸對兔VX2 肝癌經(jīng)TAE 術(shù)后癌旁肝組織氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的作用，為臨床如何改善經(jīng)導(dǎo)管動脈栓塞術(shù)后患者預(yù)后提供新思路。

圖6 各組癌旁肝組織SOD1、Bcl-2、Caspase-3 蛋白相對表達(dá)（n=3）Fig.6 SOD1，Bcl-2，Caspase-3 relative expression（n=3）

本次實驗結(jié)果顯示TAE 組肝功能明顯下降，病理圖片中凋亡細(xì)胞明顯增多，而聯(lián)合治療組肝功能明顯改善，病理圖片中凋亡細(xì)胞明顯減少，提示TAE 術(shù)后肝功能不同程度受損，匹立尼酸具有改善TAE 術(shù)后肝功能不全的效果，與以往的實驗結(jié)果相符。丙二醛（Malondialdehyde，MDA）的含量可以反映氧化應(yīng)激損傷的嚴(yán)重程度［18］。SOD、GSH-Px、CAT 是抗氧化損傷的主要防御系統(tǒng)［19］，其中超氧化物歧化酶尤為重要，目前人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的SOD 分為三類，包括SOD1、SOD2、SOD3，研究發(fā)現(xiàn)酵母菌SOD1 和SOD2 缺乏時更容易受氧化應(yīng)激影響，尤其是SOD1 缺乏［20-21］。TAE 術(shù)后MDA 含量明顯增加，抗氧化酶SOD、GSH-Px、CAT 活性明顯降低，直接和間接的提示TAE 術(shù)后癌旁肝組織ROS產(chǎn)生過多，抗氧化能力減弱，而預(yù)先使用匹立尼酸后癌旁肝組織ROS 產(chǎn)生明顯減少，抗氧化酶活性明顯增強(qiáng)，同時SOD1 的mRNA 和蛋白表達(dá)也明顯增高，提示匹立尼酸可以減少ROS 的產(chǎn)生，增強(qiáng)抗氧化酶的活性，同時也可以促進(jìn)SOD1 的表達(dá)。TAE 術(shù)后癌旁肝組織Bcl-2 表達(dá)明顯減少，Caspase-3 表達(dá)明顯增加，細(xì)胞凋亡增加，預(yù)先使用匹立尼酸后Bcl-2 表達(dá)明顯增加，Caspase-3 表達(dá)明顯減少，提示匹立尼酸可以促進(jìn)抗凋亡因子Bcl-2 的表達(dá)，抑制Caspase-3 的表達(dá)。COLLINO 等［22］、BARLAKA 等［23］研究表明PPAR-α激動劑WY-14643 通過抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，減少細(xì)胞凋亡，從而緩解小鼠大腦、心臟缺血/再灌注損傷。非酒精性脂肪肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）如今成為了導(dǎo)致HCC的主要危險因素［24］，PANTAZI等［25］發(fā)現(xiàn)PPAR-α激動劑WY-14643 可以通過抗氧化應(yīng)激作用來抑制小鼠NAFLD 的缺血/再灌注損傷，減少細(xì)胞凋亡，并可防止NAFLD 演變?yōu)镠CC。以上結(jié)果表明WY-14643 可以減輕損傷保護(hù)肝臟，本次實驗結(jié)果之相符，但是WOODS 等［26］發(fā)現(xiàn)PPAR-α激動劑WY-14643會誘導(dǎo)小鼠肝臟氧化應(yīng)激損傷。不過與本文類似的研究結(jié)果絕大多數(shù)都與前者相符，此外，類似的研究基本上是用小鼠建模，而本次研究則是通過兔建模并發(fā)現(xiàn)了PPAR-α激動劑匹立尼酸可以增強(qiáng)抗氧化酶的活性并增加SOD1 的表達(dá)來抑制氧化應(yīng)激，增加Bcl-2 和減少Caspase-3 表達(dá)來減少細(xì)胞凋亡，從而改善肝組織缺血/再灌注損傷，緩解TAE 術(shù)后肝功能損傷。線粒體參與的凋亡是最為重要的細(xì)胞凋亡途徑，ZHOU 等［27］研究發(fā)現(xiàn)ROS 的增加可以抑制PI3K/Akt，使得線粒體膜上的Bax 表達(dá)增加，Bcl-2 表達(dá)減少，最終導(dǎo)致線粒體Caspase-9、Caspase-7、Caspase-3 釋放增加，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；同時Akt 降低可引起p53 升高，p21 減低，cdc2 和CyclinB1 降低，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯（G2/M 期），由此推測PPAR-α激動劑WY-14643 也可能通過調(diào)節(jié)ROS/PI3K/Akt 通路來緩解細(xì)胞凋亡，同時對細(xì)胞周期可能也有調(diào)節(jié)作用，使得細(xì)胞周期停滯，一定程度上可能具有抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用。ZHANG 等［28］研究發(fā)現(xiàn)通過激活JAK2/STAT3 通路，可以增強(qiáng)機(jī)體抗氧化酶，從而緩解缺血再灌注所致的氧化應(yīng)激損傷，減少心肌細(xì)胞凋亡，結(jié)合本研究結(jié)果，推測WY-14643 也可能通過激活PPAR-α來增加JAK2/STAT3表達(dá)，從而增強(qiáng)機(jī)體抗氧化酶（S0D、GSH-Px、CAT），緩解氧化應(yīng)激損傷，減少正常肝細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)不同通路都與ROS 過多所致的氧化應(yīng)激關(guān)系密切，因此，如何有效減少ROS 是緩解缺血/再灌注所致細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵。

PPAR-α改善氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)機(jī)制比較復(fù)雜，本研究的相關(guān)因子較為表淺，對于PPAR-α具體是如何通過調(diào)節(jié)相關(guān)因子轉(zhuǎn)錄來改善氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡還需應(yīng)用基因敲除、相關(guān)因子抑制劑等技術(shù)進(jìn)一步研究。在實驗設(shè)計方面略為簡單。同時本次實驗也缺乏ROS 含量的直接測量指標(biāo)。

綜上所述，PPAR-α激動劑匹立尼酸可以一定程度的改善TAE 術(shù)后兔癌旁正常肝組織因氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡所致的肝功能下降，對于臨床上肝癌TAE 術(shù)后患者肝功能不全的預(yù)防及治療具有重要意義，但是具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。