殼聚糖-迷迭香鍍冰衣對卵形鯧鲹凍藏期間品質變化影響

藍蔚青，趙欣宇，鞏濤碩，謝 晶

（上海海洋大學 1.食品學院/ 2.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心/ 3.食品科學與工程國家級實驗教學示范中心，上海 201306）

卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）又名金鯧、鯧鲹，為鱸形目鲹科鯧鲹屬暖水性水產動物，主要生活在熱帶及溫帶沿海，其肉白色細嫩，富含脂肪，且鮮美甜口，該魚種發展潛力巨大。

凍藏是保持卵形鯧鲹鮮度的主要方式，但長期凍藏會導致其蛋白質變性[1]、干耗[2]、脂肪氧化[3]等，使品質變劣。采用鍍冰衣處理可延緩水產品在凍藏過程中的品質劣化[4]。鍍冰衣是水產原料凍結后，將其置于預冷的冰衣液中，由于魚體表面與冰衣液具有溫度差，可在其體表形成冰層的保鮮方法。鍍冰衣處理后可將樣品與空氣隔離，防止長時間貯藏的干耗與空氣氧化，進一步延長其貨架期[5]。其中，趙啟蒙等[6]研究發現，在-18 ℃與-25 ℃凍藏鯰魚（Silurus asotus）3 個月，同一凍藏溫度鍍冰衣處理可延緩鯰魚的腐敗，更好保持其鮮度。目前主要使用冰衣液對水產品體表鍍層，雖然相比未鍍冰衣處理，其可適當延緩水產品的品質劣變，但單一鍍冰衣處理仍存在抗氧化性差、抑菌效果不足等缺點[4]，故可在冰衣液中添加具有抗菌、抗氧化活性的生物保鮮劑以提升保鮮效果。

殼聚糖（Chitosan，CS）是由(1,4)-連接的-2-氨基-脫氧-b-D-葡聚糖組成的天然陽離子多糖，是甲殼素的脫乙酰產物。由于其具有無毒、抗氧化、抗菌與抗真菌特性，還有生物降解、相容性與成膜性，可作為可食性薄膜來延長食品貨架期[7]。迷迭香（Rosmarinus officinalis，RE）的葉子和花中富含抗氧化成分迷迭香酸，其可提取抗氧化劑或提煉迷迭香精油，也能作為食品調味劑使用。目前迷迭香提取物已列入GB 2760—2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》中，可作為食品抗氧化劑[8]。此后，Choulitoudi 等[9]評估了迷迭香提取物對4 ℃冷藏的熏制鰻魚（Anguilla anguilla）的抗氧化效果，得出迷迭香提取物可明顯延緩鰻魚片初級和次級氧化產物的形成；Shi 等[10]發現用迷迭香提取物對冷凍泥蝦（Solenocera melantho）上釉后，能顯著降低冷凍儲存24 周期間蝦的質量損失、蛋白質降解與脂質氧化。

目前冰衣在水產品保藏中已有應用，但復合鍍冰衣用于水產品保鮮的研究報道尚少。基于此，本研究擬選取殼聚糖與迷迭香提取物復合鍍冰衣處理卵形鯧鲹，期間通過理化（TBA 值、FR 值、pH值、TVB-N 值、TPA 值）、微生物（菌落總數）分析，結合LF-NMR 與MRI 技術，綜合表征殼聚糖與迷迭香提取物復合鍍冰衣對卵形鯧鲹凍藏期間品質變化影響，以期為該鍍冰衣技術的應用推廣提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗原料：卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）購于上海市自發漁業專業合作社，選取質量在（500±50）g，體長在（30±5）cm 的鮮活樣品，并在30 min 內運至實驗室。

藥品試劑：殼聚糖（脫乙酰度90%，分子質量70～ 80 ku）購自上海高信化玻儀器有限公司；迷迭香提取物（水溶性提取物，食品級，純度99%，主要成分為：迷迭香酸）購自上海維編科技有限公司；平板計數瓊脂（plate count agar，PCA）購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司；輕質氧化鎂、磷酸緩沖液等購自國藥集團化學試劑有限公司，均為國產分析純。

1.2 主要儀器設備

TA.XT Plus型質構儀，英國Stable Micro System公司；Alliance 2695 型高效液相色譜（High Performance Lipid Chromatography，HPLC）系統，美國Waters 公司；JX-05 拍打式無菌均質器，上海凈信實業有限公司；Meso MR23-060H-I 型核磁共振成像分析儀，上海紐邁電子科技有限公司等。

1.3 方法

1.3.1原料處理 將卵形鯧鲹置于速凍機中，凍結至魚體中心溫度為-20 ℃。將樣品隨機分成四組，分別使用無菌水（CK）、2.0 g/L 迷迭香提取物（RE）、5.0 g/L 殼聚糖結合2.0 g/L 迷迭香提取物（CS1+RE）與15.0 g/L 殼聚糖結合2.0 g/L 迷迭香提取物（CS2+RE）進行鍍冰衣處理。預冷冰衣液溫度控制在2～ 6 ℃，通過浸漬將卵形鯧鲹在冰衣液中鍍冰衣10～ 15 s，冰衣量保持在（10±1）%（質量分數）。樣品用自封袋分裝好后放入-20 ℃冰箱中凍藏5 個月，期間每月隨機選取各組樣品，解凍后取魚肉進行相關指標測定。

1.3.2理化指標

1.3.2.1硫代巴比妥酸（TBA）值 參考Yu 等[11]法，稍作修改。稱取5.0 g 樣品置于50 mL 離心管中，隨后加入25 mL 200 g/L 的TCA 溶液均質，靜置1 h 后以48 000 r/min 轉速離心10 min，過濾。濾液用蒸餾水定容至50 mL，取5 mL 濾液向其中加入5 mL 0.02 mol/L 的TBA 溶液后混勻，沸水浴20 min，待冷卻后在532 nm 處用分光光度計測定其光密度（D）。結果以mg/kg 表示，由光密度D 和標準曲線計算TBA 值。

1.3.2.2熒光比值（Fluorescence Ratio，FR）參考石徑[12]的方法并稍作修改，取5 g 魚肉于離心管中；加入10 mL 甲醇浴5 mL 氯仿后勻漿，加5 mL氯仿沖洗，混勻后加5 mL 水，于1 500 r/min 離心10 min，過濾至離心管。在激發波長327/415 nm，發射波長393/463 nm 處進行脂質提取物所含熒光物質測定，用硫酸奎寧校標樣品的熒光值。相對熒光值RF（Relative Fluorescence）由下列計算得出：

其中，F 為樣品激發波長或發射波長吸收值，Fst為硫酸奎寧標樣在相應激發波長或發射波長吸收值。結果用熒光比值表示：

1.3.2.3pH 值與TVB-N 值 參考GB 5009.237-2016[13]，利用pH 計測定樣品在不同時期的pH 值。參考GB 5009.228—2016[14]半微量定氮法原理，使用全自動凱氏定氮儀測定樣品的TVB-N 值，平行測定3 次，結果單位以mg/100 g 表示。

1.3.2.4質構分析（TPA）參考TAN 等[15]的方法進行質構分析。取20 mm×20 mm×10 mm 的魚肉，吸除表面水分后，分別使用TA.XT Plus 型質構儀測定樣品的硬度、黏性與彈性值，每個樣品經歷2 次壓縮分析。測定條件：探頭型號為P/50 平底柱狀探頭，測前速度為3 mm/s；測試速度和測試后返回速度均為1 mm/s；二次壓縮間隔時間5 s，壓縮程度50%，弛豫時間5 s。最后結果取平行測定6 次，取平均值。

1.3.2.5K 值 參考Mohan 等[16]的方法并稍作修改。在5.0 g 魚樣加入體積分數10%的預冷HClO4溶液10 mL，攪拌后均質，在4 ℃、9 000 r/min 條件下離心15 min，取上清液放入離心管中，沉淀物中加入10 mL 體積分數5%的預冷高氯酸溶液，攪拌混勻后離心，合并上清液，沉淀重復步驟2 次。上清液用10 mol/L KOH、1 mol/L 的KOH 溶液調至pH 值為6.5，靜置30 min 后過濾。濾液于容量瓶中用超純水定容，孔徑0.22 μm 濾膜過濾后分裝至液相進樣瓶中于冷凍室中保存待測。參照Huang等[17]法計算K 值。

1.3.3菌落總數（Total viable count，TVC）值 參考GB 4789.2-2016[18]測定樣品的菌落總數，平行測定3 次，結果以對數值表示。

1.3.4低場核磁共振LF-NMR 與核磁共振MRI參考Cao 等[19]的方法用核磁共振分析儀測定樣品的橫向弛豫時間（T2）和水分分布。MRI 采用核磁共振成像儀測定魚肉的質子密度圖譜，將樣品放入核磁管中，在核磁共振成像儀中分析。最終的魚肉質子密度圖譜由8 次掃描重復累加所得，質子密度圖由蘇州紐邁公司軟件統一映射、偽彩。

1.4 數據處理

使用OriginPro 8.5 軟件繪圖；采用SPSS 19.0中的單因素方差分析和Duncan 新復極差法多重比較進行統計分析，結果以Means±SD 表示。

2 結果與討論

2.1 硫代巴比妥酸TBA 值

卵形鯧鲹在凍藏期間會發生氧化酸敗，不飽和脂肪酸會氧化生成降解產物——丙二醛，其與TBA反應生成粉紅色化合物。魚肉的TBA 值與凍藏時間及溫度具有相關性，數值越高，表明其脂肪氧化越嚴重[20]。因此，可由光密度值來判斷水產品脂肪氧化程度。

由圖1 可知，新鮮樣品初始TBA 值為（0.33±0.04）mg/kg。隨著貯藏時間的延長，各組樣品的TBA 值隨之升高。其中，對照組與處理組樣品的TBA 值在凍藏初期的2 個月無顯著差異（P＞0.05）。在凍藏2 個月后，殼聚糖與迷迭香提取物復合鍍冰衣處理組樣品的TBA 值增長速度減緩。到凍藏第5個月時，CK、RE、CS1+RE 與CS2+RE 處理樣品的TBA 值分別增至（1.49±0.08）、（1.4±0.06）、（0.9±0.05）和（0.48±0.05）mg/kg，表明與單獨使用迷迭香提取物相比，復合鍍冰衣處理能較好延緩卵形鯧鲹貯藏期間的脂肪氧化速率，延長其貨架期，且復合鍍冰衣作用效果與殼聚糖濃度正相關。這可能是因為殼聚糖可清除DPPH?自由基，且具有較好的抑菌活性，可抑制樣品貯藏期間的脂質氧化[21]。

圖1 殼聚糖-迷迭香提取物復合鍍冰衣對卵形鯧鲹凍藏期間TBA 值變化影響Fig.1 Effect of chitosan and rosemary extract composite glazing on TBA changes in Trachinotus ovatus during frozen storage

2.2 熒光比FR 值

通過熒光化合物的形成，可評估存在于卵形鯧鲹魚肉中的初級與次級脂質氧化產物及親核分子間的相互作用[22]。不同類型鍍冰衣處理對卵形鯧鲹凍藏期間的熒光比值變化影響如圖2 所示。

由圖2 可知，樣品的初始FR 值為1。隨著貯藏時間的延長，各組樣品的FR 值相應升高。從貯藏的第1 個月起，對照組樣品的FR 值已超過2，而復合鍍冰衣處理組樣品的FR 值仍低于1.5。其中，CS2+RE 復合鍍冰衣處理組樣品的FR 值最低。可見，CS2+RE 復合鍍冰衣處理可更好抑制樣品凍藏期間脂肪氧化，這與TBA 值的結果一致。脂肪氧化是一個復雜的過程，會產生很多中間產物，由上述結果可表明，CS2+RE 復合鍍冰衣處理能夠抑制二級（TBA）和三級（熒光化合物）脂質氧化化合物的形成[22]。

圖2 殼聚糖-迷迭香提取物復合鍍冰衣對卵形鯧鲹凍藏期間熒光比值變化影響Fig.2 Effect of chitosan and rosemary extract composite glazing on the changes of fluorescence ratio in Trachinotus ovatus during frozen storage

2.3 菌落總數

菌落總數是評價水產品品質的重要指標，不同鍍冰衣方式對卵形鯧鲹凍藏期間TVC 值變化影響如圖3 所示。

由圖3 可知，新鮮樣品的TVC 值為1.70±0.14。隨著貯藏時間的延長，各組樣品的TVC 值隨之升高。與CK、RE 鍍冰衣組相比，殼聚糖結合迷迭香提取物鍍冰衣對微生物的抑制效果較好，其中又以CS2+RE 鍍冰衣組作用效果最佳，其在貯藏第5個月時的TVC 值為2.99±0.08。可能是因為殼聚糖能通過影響菌體細胞膜通透性、破壞其細胞壁，微生物的結構遭到破壞，生命活動紊亂而達到抑菌目的；迷迭香提取物中的酚類和萜類物質破壞了菌體細胞膜，抑制其生長繁殖[23-24]。

圖3 殼聚糖-迷迭香提取物復合鍍冰衣對卵形鯧鲹凍藏期間TVC 變化影響Fig.3 Effect of chitosan and rosemary extract composite glazing on TVC changes in Trachinotus ovatus during frozen storage

2.4 pH 值與揮發性鹽基氮TVB-N 值

由圖4a 可見，樣品初始pH 值在6.97±0.03，該值在凍藏前2 個月呈下降趨勢并達到最低點，后期逐漸升高。這是由于水產品在貯藏前期，糖類物質通過無氧氧化產生乳酸，各組樣品的pH 值隨之下降。后期，隨著貯藏時間的延長，水產品體內微生物分解產生含氮類化合物，pH 值相應升高，這與前人研究結果一致[25]。與迷迭香提取物鍍冰衣組樣品相比，復合鍍冰衣組樣品的pH 值始終較低，但兩組復合處理組差異不顯著（P＞0.05）。由此表明，殼聚糖與迷迭香提取物的加入能通過抑制微生物生長，從而減少含氮類化合物分解，減緩樣品貯藏后期pH 值的上升，抑制其腐敗，這與TVC 的結果一致。該研究結果與譚明堂等[26]一致。

總揮發性鹽基氮是微生物和酶作用下的蛋白質降解產物，可用于評估海產品新鮮度[27]。根據SC/T 3101-2010 鮮凍大黃魚標準顯示，TVB-N 值＜18 mg/100 g 為一級鮮度，18 mg/100 g≤TVB-N 值＜0 mg/100 g 為二級鮮度[28]。不同鍍冰衣處理組樣品凍藏期間的TVB-N 值變化如圖4b 所示。新鮮樣品的TVB-N 值為（9.50±0.23）mg/100 g，各組樣品在凍藏前兩個月的TVB-N 值變化不顯著（P＞0.05）。隨著凍藏時間的延長，對照組與處理組樣品RE、CS1+RE 與CS2+RE 處理樣品的TVB-N 值分別增至（18.37±0.27）、（16.82±0.24）、（13.89±0.36）和（13.57±0.05）mg/100 g。與對照組相比，復合鍍冰衣處理樣品在凍藏期間TVB-N 值處于一級鮮度。以CS2+RE 處理樣品的TVB-N 值最低，表明殼聚糖與迷迭香提取物能通過抑制微生物繁殖，從而減緩TVB-N 值的上升，且作用效果與殼聚糖濃度正相關，這與TVC 的分析結果一致。Sun 等[21]研究發現殼聚糖與蘋果多酚復合處理冷藏草魚（Ctenopharyngodon idellus）片，可抑制其貯藏期間TVB-N 值上升。

圖4 殼聚糖-迷迭香提取物復合鍍冰衣對卵形鯧鲹凍藏期間pH 值與TVB-N 值變化影響Fig.4 Effect of chitosan and rosemary extract composite glazing on pH and TVB-N value in Trachinotus ovatus during frozen storage

2.5 質構分析

質構是評價水產品品質變化的重要指標，其主要包括硬度、黏性與彈性等[29]。由表1 所示，對照組樣品的硬度與彈性值隨著貯藏時間的延長逐漸下降，黏性值隨之升高。可能因為魚肉在微生物與酶的作用，其肌肉結構受到破壞，硬度與彈性降低，使可溶性固形物隨著汁液流失過程滲出，導致黏性增加[30]。與對照組樣品相比，單一與復合鍍冰衣處理組樣品的硬度值與彈性值降幅更緩，黏性值處于低水平。其中，復合鍍冰衣處理效果優于單一迷迭香處理組，可能是殼聚糖與迷迭香具有良好的抗氧化與抗菌作用，起到保護屏障作用，保持其良好的質構特性。

表1 殼聚糖-迷迭香提取物復合鍍冰衣對卵形鯧鲹凍藏期間質構變化影響Table 1 Effect of chitosan and rosemary extract composite glazing on TPA changes in Trachinotus ovatus during frozen storage

2.6 K 值

K 值可客觀反映海水魚類的新鮮度，作為其在貯藏階段的主要鮮度指標[31]。當K 值＜20%為優良，20%≤K 值＜60%為中等，K 值＞60%為腐敗[32]。

由圖5 可知，新鮮樣品的K 值為（14.1±0.2）%，表明其品質較好。隨著貯藏時間的延長，各組樣品的K 值在貯藏第1 個月后顯著升高。其中，單一與復合鍍冰衣處理組樣品的K 值上升幅度緩于對照組。凍藏5 個月時，CK、RE、CS1+RE 與CS2+RE處理樣品的K 值分別為（43.8±0.1）%、（36.5±0.6）%、（36.0±1.5）%、（33.0±0.5）%。表明單一鍍冰衣與復合鍍冰衣處理能延緩樣品凍藏期間ATP 的降解速度，保持其良好品質，尤其以CS2 +RE 處理效果更佳，該結果與謝晶等[33]研究一致。這可能是因為殼聚糖與迷迭香提取物復合鍍冰衣處理，降低了樣品凍藏期間的核苷酸酶活性，抑制其ATP 降解。

圖5 殼聚糖-迷迭香提取物復合鍍冰衣對卵形鯧鲹凍藏期間K 值變化影響Fig.5 Effect of chitosan and rosemary extract composite glazing on the changes of K value in Trachinotus ovatus during frozen storage

2.7 低場核磁共振LF-NMR 與核磁共振MRI

LF-NMR 通過測定樣品中質子橫向弛豫時間（T2）的衰減來分析其含水量。表2 顯示了卵形鯧鲹樣品在凍藏期間的水分遷移變化。

由表2 可知，樣品在貯藏初期時不易流動水較多，隨著貯藏時間延長，水分狀態逐漸向自由水轉變。即水分由胞內結合水與不易流動水轉化為胞外自由流動水[34]。不易流動水含量的降低，表明樣品的保水性下降。單一與復合鍍冰衣處理組樣品的不易流動水含量雖有所下降，但其保水性仍優于對照組。其中，以殼聚糖結合迷迭香提取物鍍冰衣的作用效果最佳，且保水性與殼聚糖濃度成正比。

表2 殼聚糖-迷迭香提取物復合鍍冰衣對卵形鯧鲹凍藏期間水分遷移變化影響Table 2 Effect of chitosan and rosemary extract composite glazing on the changes of water migration in Trachinotus ovatus during frozen storage %

一般情況下，MRI 圖像中的亮度越強（由加權像轉化的偽彩圖中越趨紅色），即此部位的水質子信號越強，該部位的水分含量就越高。不同類型鍍冰衣處理對卵形鯧鲹凍藏期間核磁成像變化影響如圖6 所示。

圖6 殼聚糖-迷迭香提取物復合鍍冰衣對卵形鯧鲹凍藏期間MRI 變化影響Fig.6 Effect of chitosan and rosemary extract composite glazing on the changes of magnetic resonance imaging (MRI) in Trachinotus ovatus during frozen storage

由圖6 可知，卵形鯧鲹樣品隨著凍藏時間的延長，其偽彩圖的亮度變弱，品質相應下降。其中，CK 組樣品的含水量下降最快，其在第5 個月時的偽彩圖亮度最低。而CS2+RE 復合鍍冰衣組樣品在凍藏期間始終保持高亮。可見，樣品經復合鍍冰衣處理后，能較好保持樣品貯藏期間的含水量，使卵形鯧鲹凍藏期間的綜合品質相對最佳。

2.8 相關性分析

殼聚糖-迷迭香復合鍍冰衣對卵形鯧鲹凍藏期間的pH 值、TBA 值、TVB-N 值、K 值與TVC 值的相關性分析如表3 所示。由表3 可知，樣品貯藏期間的TBA 值與TVB-N 值顯著相關（P＜0.05），與K 值、TVC 值極顯著相關(P＜0.01)。這是因為樣品隨著凍藏時間的延長，其中的蛋白質等含氮類物質易在微生物的作用下降解，對其質構特性產生影響，使其鮮度下降。

表3 殼聚糖-迷迭香提取物復合鍍冰衣對卵形鯧鲹凍藏期間作用影響的指標間相關性分析Table 3 Correlation analysis of chitosan and rosemary extract composite glazing on Trachinotus ovatus during frozen storage

3 結論

殼聚糖結合迷迭香提取物鍍冰衣處理，能有效抑制卵形鯧鲹凍藏期間的脂肪氧化以及微生物繁殖，延緩其pH 值、TVB-N 值、K 值的上升，保持良好的硬度、黏性與彈性值。同時，還能減緩樣品貯藏期間的水分流失，提升其綜合品質。其中以15.0 g/L 殼聚糖與2.0 g/L 迷迭香復合鍍冰衣處理效果最佳。因此，殼聚糖與迷迭香復合鍍冰衣可用于卵形鯧鲹的凍藏保鮮，該研究結果為海產品貯藏保鮮研究提供一定理論參考。