藜麥固態發酵及其產物的體外抗氧化性質研究

李夢瑤，石俊如，布合加爾·克熱木尼亞孜，曹洪偉，黃 凱，李 森，管 驍?

（上海理工大學 醫療器械與食品學院，上海 200093）

藜麥（Chenopodium quinoa Willd）是一種原產于南美洲安第斯山脈地區的農作物，屬莧科藜屬的一年生雙子葉植物[1]，其種子顏色主要有黑、紅、白幾種顏色[2]。藜麥營養價值豐富，富含氨基酸、優質蛋白質以及多酚、皂苷等生物活性物質[3-5]，其蛋白質氨基酸比例均衡，可調節機體的脂肪代謝，進而起到降低血脂的作用；與其他谷物相比，藜麥具有很高的抗氧化能力，可作為天然抗氧化劑的來源，也被推薦為最適合人類的完美全營養食品[6]，現已被多個國家引進種植，我國在 1987年將其引進西藏地區并開始種植，自2015年更是在山西、內蒙、青海等多個地區開始種植[7]。

近年來，藜麥已經引起各類研究者、生產者及普通消費者廣泛的關注，但藜麥作為有待普及和推廣的新興作物，對藜麥的理論研究和開發利用尚有待深入。固態發酵（Solid State Fermentation，SSF）是指利用不溶性固體基質來培養微生物的過程，培養基呈固態，含水豐富，但沒有或幾乎沒有自由流動水的狀態下進行的一種或多種微生物發酵過程，底物（基質）是不溶于水的聚合物，它不僅可以提供微生物所需碳源、氮源、無機鹽、水及其它營養物，還是微生物生長的場所[8-9]。固態發酵是一種經濟高效的綠色發酵方式[10]，有文獻表明固態發酵可以提高谷物營養價值[11]，但目前對藜麥進行固態發酵的研究較少。

本研究以三種不同顏色種類的藜麥為原料，對其進行固態發酵，測定其發酵產物中總糖、總酸、氨基酸態氮含量，并測定其 pH值，篩選出營養價值高的藜麥品種；并研究藜麥固態發酵后發酵產物的抗氧化活性，以 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率和鐵離子還原能力為指標，篩選抗氧化性能最優的藜麥品種，旨在全面揭示不同顏色藜麥品種之間抗氧化性質的差異，同時為藜麥食品的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

黑色藜麥、紅色藜麥、白色藜麥：山西五臺山；麥曲、塊曲：上海金楓酒業有限公司；酵母：安琪酵母股份有限公司。

亞鐵氰化鉀三水合物、無水硫酸銅、甲基紅、亞甲基藍、酒石酸鉀鈉、D-無水葡萄糖、三氯乙酸：上海維塔化學試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、沒食子酸：上海阿拉丁生物科技股份有限公司；福林酚、氫氧化鈉、鹽酸、六氰合鐵酸鈉、二水合磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉、無水三氯化鐵、甲醛：國藥集團有限公司。

1.2 主要儀器與設備

霉菌培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；Himac CR22N高速冷凍離心機：日本日立公司；L550臺式低速大容量離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司；UV-2800A型紫外可見分光光度計：美國尤尼柯公司；WK2102T電磁爐：美的集團有限公司；IKA RO5多點磁力攪拌器：艾卡儀器設備有限公司；FE20 pH計：梅特勒–托利多儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 藜麥預處理

將160 g藜麥在320 mL蒸餾水中浸泡1 h，瀝干水分，然后放入墊有四層紗布的蒸鍋上蒸煮30 min，將蒸熟的藜麥放在鐵盤中平鋪放開涼至溫度30 ℃以下備用。

1.3.2 固態發酵

將藜麥、128 mL蒸餾水、4 g麥曲、12 g塊曲、酵母液（0.16 g酵母溶于16 mL糖水中，在35 ℃水浴加熱15 min）混合均勻，四層紗布封口放入霉菌培養箱中，溫度設定為28 ℃。

分別取 12、24、36、48、60、72、84、96 h的發酵液。將發酵完的藜麥在4 000 r/min條件下離心30 min，并用濾紙過濾，取得原液，在4 ℃保存，備用待測。

1.3.3 總糖的測定

總糖的測定：根據國標 GB/T 13662—2018《黃酒》采用亞鐵氰化鉀滴定法測定。預先配好費林試劑甲、乙液，葡萄糖標準溶液（1 g/L），6 mol/L HCl溶液，200 g/L NaOH溶液，1 g/L甲基紅指示液。

吸取費林甲溶液和費林乙溶液各 5 mL于100 mL錐形瓶中，加入葡萄糖標準溶液9 mL，搖勻后加入2粒沸石，置于電爐上加熱，在2 min內沸騰，然后用葡萄糖標準溶液滴定，直至藍色消失變為黃色，記作滴定終點，記錄消耗的葡萄糖標準溶液的體積V1。

1.3.3.1 制樣 吸取試樣5 mL于100 mL容量瓶中，加入蒸餾水30 mL和HCl溶液5 mL，在70 ℃水浴中加熱15 min，冷卻，加入兩滴甲基紅指示液，用 NaOH溶液中和至紅色消失。加水定容100 mL，搖勻，過濾，作為試樣水解液備用。

1.3.3.2 預滴定 吸取費林甲液、乙液及試樣水解液各5 mL于100 mL錐形瓶中，搖勻后加入2粒沸石置于電爐上加熱至沸騰，用葡萄糖標準溶液滴定至終點，記錄消耗的葡萄糖標準溶液的體積 V2。

1.3.3.3 滴定 吸取費林甲液、乙液及試樣水解液各5mL于100 mL錐形瓶中，加入比預滴定少1.00 mL的葡萄糖標準溶液，搖勻后加入2粒沸石置于電爐上加熱至沸騰，用葡萄糖標準溶液滴定至終點。記錄消耗的葡萄糖標準溶液的體積（V3）。

試樣中總糖含量X計算為：

式中：

ρ——葡萄糖標準溶液的濃度，單位為g/mL；

n——試樣的稀釋倍數。

1.3.4 總酸和氨基酸態氮的測定

參照劉安康[12]等實驗方法并調整，吸取試樣10 mL于100 mL錐形瓶中，加入蒸餾水50 mL。錐形瓶中放入磁力攪拌子，置于磁力攪拌器上攪拌。用0.1 mol/L NaOH標準滴定液滴定，開始時可快速滴定至pH 7.00，此后放慢滴定速度，直至pH 8.20為終點，記錄消耗NaOH標準滴定溶液的體積V1。加入甲醛溶液10 mL，繼續用NaOH標準滴定溶液滴定至pH 9.20，記錄消耗NaOH標準滴定溶液的體積V2。同時做空白實驗，分別記錄不加甲醛溶液及加入甲醛溶液時，空白實驗實驗所消耗NaOH標準滴定溶液的體積V3、V4。

總酸含量X1如下：

酸態氮含量X2如下：

式中：

X1——試樣中總酸的含量，單位為g/L；

X2——試樣中氨基酸態氮的含量，單位為g/L；

c——NaOH標準滴定溶液的濃度，單位為mol/L；

V0——吸取試樣的體積，單位為mL。

1.3.5 總酚含量的測定

吸取2 mL離心發酵液上清，加入10 mL 80%甲醇溶液，45 ℃條件下水浴1 h，4 000 r/min離心10 min收集上清。采用Folin-酚試劑測定多酚含量[13]，取1 mL提取液，加入0.5 mL福林酚試劑，混勻后靜置 5 min，然后加入 1.5 mL 20%Na2CO3溶液，去離子水定容至10 mL，混勻后避光靜置1 h，在760 nm下測定吸光度。以沒食子酸為標準品繪制標準曲線。總酚含量以沒食子酸當量μg GAE/mL DW表示。

1.3.6 體外抗氧化指標測定

1.3.6.1 DPPH自由基清除活性 參照 Ye等[14]方法，并進行調整。配置DPPH溶液：用無水乙醇配制0.1 mmol/L的DPPH溶液，避光保存。將1 mL測試樣品溶液及1 mL DPPH溶液加入到同一試管中，搖勻，室溫下暗處靜置30 min后以3 000 r/min離心10 min，測定其吸光度Asample，同時測定1 mL DPPH溶液與1 mL乙醇混合后的吸光度Acontrol，以及1 mL測試樣品溶液與1 mL無水乙醇混合后的吸光度Ablank。

自由基清除能力的表示：

1.3.6.2 還原能力測定 參照Oyaizu[15]方法，并作調整。取 0.4 mL樣品和 1 mL磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.4）以及1 mL 1%鐵氰化鉀溶液混合，于50 ℃水浴中加熱20 min，冷卻到室溫后加入1 mL 10% TCA混勻，靜置15 min。取1 mL上清液，加入0.2 mL 0.1%三氯化鐵溶液和1 mL水。10 min后，在700 nm處測吸光度。

1.4 數據分析

使用Excel對數據進行處理，并用Origin 2018軟件進行繪圖分析，采用單因素方差分析中的Duncan多重比較法分析結果間的顯著差異（P<0.05表示具有顯著性差異）。每組實驗實驗重復3次，結果以（平均值±標準差）表示。

2 結果與分析

2.1 總糖含量變化

發酵過程中黑藜、紅藜、白藜總糖含量的變化見圖 1，從圖 1可以看出，大米在發酵過程中總糖的含量顯著高于藜麥（P<0.05），這是由于大米所含碳水化合物尤其是淀粉含量相對較高所導致，藜麥中淀粉含量通常為60%[16]，而大米淀粉含量可高達75%以上[17]。研究發現，藜麥與大米在發酵過程中均出現了總糖含量先升高后降低的趨勢，這是因為發酵前期淀粉被霉菌及其他一些細菌分泌的淀粉酶、糖化酶等大量分解導致了總糖的升高和相應微生物的增殖，但隨著總糖含量達到一定高度，酵母菌開始大量增殖且不斷消耗產生的還原糖，從而導致總糖含量的降低。其中藜麥的總糖含量在發酵24 h時達到最高，而大米則需發酵36 h。藜麥的發酵隨著時間的延長，在48 h總糖含量趨于穩定，且白藜的總糖含量要高于黑、紅藜，大米的總糖含量則持續降低，此現象與酵母的增殖與藜麥、大米中淀粉含量相關。

圖1 發酵過程中黑藜、紅藜、白藜總糖含量的變化Fig.1 Changes of total sugar content of black quinoa,red quinoa and white quinoa during fermentation

2.2 總酸含量變化

發酵過程中黑藜、紅藜、白藜總酸含量的變化見圖 2，從圖 2可以看出，大米及藜麥在發酵前期總酸含量持續上升，是整個菌群環境不斷調整的結果。不適應酸性環境的菌體生長受到抑制，能夠適應酸性環境的菌體開始不斷增殖并形成優勢菌群。結合總糖含量的變化規律，發現總酸含量在48 h時趨于穩定，與總糖含量變化趨于穩定的時間點相吻合，是弱勢菌群持續產酸而優勢菌群則以已產的有機酸為底物繼續發酵，導致了總酸含量變化減緩。相比較于藜麥，大米總酸持續增加，是因為其淀粉含量較高，從而淀粉水解時間過長。藜麥淀粉的顆粒相對較小，粒徑僅幾微米甚至納米級[18-19]，而大米淀粉顆粒則高達幾十微米，此因素也可能導致大米淀粉的水解時間相對延長，從而產酸持續增加。此外，藜麥發酵中總酸含量顯著高于大米，有可能是發酵初期，藜麥中乳酸菌增殖相對較高。

圖2 發酵過程中黑藜、紅藜、白藜總酸含量的變化Fig.2 Changes of total acid content of black quinoa,red quinoa and white quinoa during fermentation

2.3 pH的變化

在發酵過程中，藜麥的 pH變化總體呈下降趨勢，而大米的 pH則先降低再平穩最后略有上升的趨勢，結果如圖3所示。相較于大米，藜麥發酵過程中 pH的變化相對較小，由于所用發酵劑為酒曲，其中富含霉菌、酵母、乳酸菌等各類微生物，均可以產生各類酸類物質，從而可以導致 pH的降低，但相比較于藜麥，大米在發酵過程中由于淀粉含量的相對較高，發酵后期能夠通過酵母的增殖不斷將有機酸轉化為酒精，因此，pH的變化會呈現后期相對平穩甚至上升的趨勢。對于藜麥的 pH持續下降，是因為發酵后期蛋白酶對于蛋白的持續分解，由于蛋白質氨基酸組成的差異，導致游離出的氨基酸所帶酸堿性差異，從而導致了大米、藜麥的pH值存在一定區別。

圖3 發酵過程中黑藜、紅藜、白藜pH的變化Fig.3 pH changes of black quinoa,red quinoa and white quinoa during fermentation

2.4 氨基酸態氮含量變化

氨基酸態氮是指以氨基酸形式存在的氮元素的含量，可以用來判斷發酵程度。如圖4所示，隨著發酵的進行，藜麥發酵產物中氨基酸態氮總體變化呈上升趨勢，而大米則呈現先增加后穩定的趨勢。由于藜麥中蛋白質含量幾乎是大米的兩倍[20]，因此，隨著微生物分泌的蛋白酶不斷酶解蛋白，藜麥的氨基酸態氮要高于大米，發酵前期，原料中的蛋白質大都被一些高產蛋白酶微生物，如霉菌類，進行分解形成低分子的肽和游離氨基酸，因此其氨基酸態氮含量上升較快。

圖4 發酵過程中黑藜、紅藜、白藜氨基酸態氮含量的變化Fig.4 Changes of amino acid nitrogen content in black quinoa,red quinoa and white quinoa during fermentation

2.5 總酚含量變化

谷物中存在大量的多酚黃酮類抗氧化物質，主要以游離態、可溶酯化態和不溶結合態形式存在[21]，但谷物中可游離出的酚類或黃酮類物質含量相對較低，Raj等[22]研究發現固態發酵（5 d）可以顯著提高玉米總酚（游離酚）含量及抗氧化活性。通過微生物發酵法可有效釋放谷物中與淀粉、蛋白等物質結合的酚類物質，從而能有效提升抗氧化效果。如圖5所示，隨著發酵時間的延長，藜麥與大米的總酚含量不斷增加，但當發酵時間超過48 h，總酚含量呈下降趨勢。發酵前期總酚含量的增加是蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等酶的不斷增加，從而有效的釋放結合酚的結果。但隨著發酵時間的延長，微生物會消耗所產生的酚類物質，導致含量降低。此外，藜麥發酵中總酚含量顯著高于大米（P<0.05），一方面，大米經加工后，大量的酚類物質隨著脫殼、脫皮處理造成了流失，而藜麥未經過精細加工，從而保留了大部分的酚類物質；另一方面，藜麥本身的酚類物質含量就高于大米，從而在發酵釋放過程中總酚含量也高于大米。

圖5 發酵過程中黑藜、紅藜、白藜總酚含量的變化Fig.5 Changes of total phenols content in black quinoa,red quinoa and white quinoa during fermentation

2.6 DPPH自由基清除率

選用三種不同顏色的藜麥，并以大米為參照，經固態發酵后，測其發酵產物的DPPH自由基清除率，結果如圖6所示。可以看出在相同發酵條件下藜麥的DPPH自由基清除率要高于大米，在發酵48 h時，黑藜發酵產物的DPPH自由基清除率達到80%，這與其發酵后總酚含量在48 h含量達到最高呈現一致趨勢，整體來說黑藜的 DPPH自由基清除率比其他品種高。由結果知藜麥發酵產物的DPPH自由基清除率的變化趨勢與其總酚含量的變化相近，從而驗證了固態發酵釋放酚類物質可提高發酵產物的抗氧化性能。

圖6 發酵過程中黑藜、紅藜、白藜DPPH自由基清除能力的變化Fig.6 Changes of DPPH radical scavenging ability of black quinoa,red quinoa and white quinoa during fermentation

2.7 還原能力

發酵過程中黑藜、紅藜、白藜還原能力的變化見表 7，從圖 7可以看出在相同發酵條件下藜麥發酵產物的還原能力要高于大米，與DPPH自由基清除能力的變化相比，藜麥和大米發酵產物的還原能力幾乎都在48 h達到最高，僅有黑藜在60 h達到最高。藜麥發酵產物的還原能力變化趨勢與其對DPPH自由基清除能力的變化趨勢成一致性，這主要是由于其酚類物質含量的變化引起的，且黑藜的酚類含量高，故其還原能力也強。因此再一次驗證了固態發酵釋放酚類物質可提高發酵產物的抗氧化性能。

圖7 發酵過程中黑藜、紅藜、白藜還原能力的變化Fig.7 Changes of reducing ability of black quinoa,red quinoa and white quinoa during fermentation

3 結論

本研究通過對藜麥固態發酵過程中各項指標進行檢測，以大米作為參照，研究藜麥發酵過程中pH、總酸、總糖、氨基酸態氮含量的變化，這些變化與藜麥中淀粉、蛋白質含量有關并與發酵過程中微生物種群類別、數量息息相關，從實驗結果來看，黑藜與紅藜相較于白藜營養價值更高。研究發現，在發酵過程中，48 h時藜麥的總酚含量達到最高，且發酵產物的抗氧化能力與酚類物質含量高低呈現一致性，其中黑藜通過固態發酵的效果最好，其 DPPH自由基清除率最高達到80%，可知通過固態發酵技術，能有效釋放藜麥中的結合酚類物質，提高總酚含量，從而提升發酵產物的抗氧化能力。