一測多評法同步測定鉤藤飲片中3種黃烷類成分的含量

胡新華，陳玩珊，原文鵬

(深圳市人民醫院<暨南大學第二臨床醫學院，南方科技大學第一附屬醫院>藥學部，廣東 深圳 518020)

鉤藤來源于茜草科植物鉤藤[Uncariarhynchophylla(Miq.)Miq.ex Havil.]、大葉鉤藤(UncariamacrophyllaWall.)、毛鉤藤(UncariahirsutaHavil.)、華鉤藤[Uncariasinensis(Oliv.)Havil.]或無柄果鉤藤(UncariasessilifructusRoxb.)的干燥帶鉤莖枝。秋、冬二季采收，去葉，切段，曬干[1]。具有息風定驚、清熱平肝之功效。常用于肝風內動、驚癇抽搐、高熱驚厥、感冒夾驚、小兒驚啼、妊娠子癇、頭痛眩暈。研究表明，鉤藤中的生物堿類成分能夠抑制外周血管收縮，使血管阻力降低，血壓降低，同時有抗血小板聚集和抗血栓的作用，臨床上用于降血壓[2]。目前對該類成分的含量測定已多有報道。另一類黃烷類成分包括兒茶素、表兒茶素、原花青素B2等成分含量測定的報道則少有關注。因該類成分近年因廣泛的生物活性[3-9]被更多關注，并且考慮到B型原花青素對照品的不易得和穩定性較差的問題，該類成分的含量測定最優選擇為一測多評法(QAMS)。一測多評法[10]采用只測定藥材或制劑中某個代表性成分(易得、價廉、有效、穩定)，同時又可計算其他待測成分的含量，可有效克服對照品短缺等問題，還能對藥材或制劑進行多指標質量控制。對此，本文應用一測多評法實現對鉤藤飲片的多指標質量控制，即應用其中一個對照品(兒茶素)建立該成分與其余待測成分(表兒茶素、原花青素B2)間的相對校正因子，對鉤藤飲片中黃烷類成分的質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 安捷倫 1260 高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；Mettler Toledo Ms 十萬分之一電子天平(德國梅特勒公司)；KQ-500DE 超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；DLSB-5/20 低溫冷卻循環泵(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 試劑試藥 甲醇、乙腈，色譜純；乙醇、石油醚(30～60 ℃)、乙酸乙酯為分析純，水為雙蒸水。

對照品：兒茶素(含量測定用，深圳健竹生物科技有限公司，批號:20170205，純度 99.48%)；表兒茶素(含量測定用，深圳健竹生物科技有限公司，批號:20160930，純度 98.83%)；原花青素 B2對照品(自制，純度≥98.13%)。

藥材飲片：鉤藤飲片來自深圳市人民醫院中藥房，共 10 個批次，產地分別為廣西、云南和湖南。

2 方法與結果

2.1 一測多評方法學考察

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：水(A)-甲醇(B)；采用梯度洗脫程序，流動相比例為：0～30 min，10%B→47%B；30～35 min，47%B→90%B。流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長230 nm。上述色譜條件下,各組分分離度良好。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取兒茶素對照品、表兒茶素對照品及原花青素B2對照品適量，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得兒茶素、表兒茶素及原花青素B2分別為0.68、0.62、0.65 mg·mL-1的對照品溶液，備用。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱取鉤藤細粉約10.00 g，加入100 mL乙醇超聲提取30 min，過濾，濾液減壓蒸干，加入100 mL蒸餾水超聲分散，水溶液轉移至250 mL的分液漏斗中，加入石油醚(30～60 ℃)50 mL，萃取，棄去石油醚層，水層繼續加50 mL乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯層，減壓蒸干，用甲醇少量多次將樣品轉移至5 mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.4 線性和范圍 精密吸取上述混合對照品溶液2、4、6、8、10 μL,進樣分析,每個濃度進樣2次,取平均值。以進樣量對峰面積積分值進行回歸,兒茶素、原花青素B2、表兒茶素的標準曲線見表1。

表1 各檢測成分的回歸方程、相關系數和線性范圍

2.1.6 精密度試驗 精密吸取兒茶素、原花青素B2、表兒茶素供試品溶液10 μL連續進樣6次,以測得的峰面積響應值作為評價指標，得到3種成分的RSD分別為 1.2%、1.5%、1.9%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 穩定性試驗 分別取供試品 3、4、9，按照“2.1.3”項下方法操作，得到供試品溶液，分別于配制后的 0、2、4、6、8、12 和 24 h 取 10 μL進樣測定峰面積,兒茶素、原花青素B2和表兒茶素在24 h內峰面積的RSD分別為1.1%、1.6%、1.4%。表明處理后的樣品在24 h內穩定。

2.1.8 重復性試驗 稱取同一批鉤藤樣品2的藥材粉末共 6 份，精密稱定，按照“2.1.3”項下方法操作，得到供試品溶液，測定兒茶素、原花青素B2和表兒茶素的平均含量分別為0.018%、0.0041%和0.0085%；RSD分別為1.3%、0.7%、1.6%。

2.1.9 加樣回收率試驗 精密稱取適量含量已知的鉤藤粉末9份，精密稱定，隨機分為3組，每組按照藥材含量80%、100%、120%的比例分別加入兒茶素、原花青素B2、表兒茶素對照品，加入甲醇補足至5 mL，按“2.1.3”項下制備供試品，測定，計算加樣回收率，兒茶素、原花青素B2、表兒茶素的加樣回收率分別為 99.8%、100.7%、100.3%，RSD分別為2.7%、2.2%、3.0%。

2.2 校正因子重現性考察

2.2.1 色譜柱及高效液相色譜儀考察 試驗考察了Waters 2695-2996、Agilent 1260兩種高效液相色譜系統，每種型號的儀器各一臺,考察了Agilent Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Inertsil ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)兩種色譜柱。計算原花青素B2、表兒茶素對兒茶素的相對校正因子依次在0.600～0.724、0.694～0.769，其中不同儀器所得相對校正因子的RSD在1.2%～5.0%，同一儀器不同色譜柱所得相對校正因子的RSD在0.29%～4.9%。

2.2.2 待測組分色譜峰的定位 根據兒茶素的保留時間，計算原花青素B2和表兒茶素對于兒茶素的相對保留時間，可對其色譜峰進行定位，考察相對保留時間在不同品牌儀器和不同規格色譜柱中的重現性，其中原花青素B2對兒茶素的相對保留時間在1.102～1.124,表兒茶素的相對保留時間在2.195～2.306，RSD分別為0.66%、2.1%。

2.2.3 一測多評法與外標法結果比較 精密吸取不同批次飲片供試品溶液各 5 μL 進樣并測定。采用外標法和一測多評法分別計算鉤藤飲片中兒茶素、原花青素B2、表兒茶素的含量,結果見表2。

表2 外標法和一測多評(QAMS)法測定鉤藤飲片中目標成分含量(mg·mL-1)

比較兩種方法所得到的含量值,其中原花青素B2的相對誤差在0.8%～2.6%,表兒茶素的相對誤差在0%～5.0%，表明兩種含量測定方法得到的含量值之間無顯著性差異,一測多評法應用于鉤藤飲片中3種成分的含量測定可行性較高。

3 討論

3.1 提取溶劑考察 本試驗考察了甲醇、乙醇和水作為提取溶劑進行提取,發現使用體積分數為95%乙醇對供試品進行超聲提取，3種目標成分提取率較高,分離度較好。

3.2 檢測波長選擇 通過對兒茶素、原花青素B2和表兒茶素進行全波長掃描發現，3種成分紫外吸收十分相似，均在 230 nm 處有最大吸收，在 270 nm 處有肩峰，故選取 230 nm 為檢測波長。

3.3 檢測結論 從檢測結果來看，3種成分中兒茶素含量最高，其次是表兒茶素，原花青素B2含量最低；從產地來看，云南產鉤藤飲片中3種成分的含量較高。

3.4 一測多評方法建立的相關考察 本試驗考察了常用不同廠家液相色譜儀器、不同類型色譜柱，結果表明，由于3種成分均為黃烷類成分，紫外吸收相近，相對校正因子的RSD值差異較小,因此利用一測多評的相對校正因子對其進行質量控制是合理可靠的。含量測定結果表明不同產地的鉤藤飲片中3種黃烷類成分含量及比例差異較小，用QAMS計算值與外標法實測值之間沒有顯著性差異，說明建立的校正因子具有較好的可信度。

4 結論

鉤藤中的生物堿類成分一直是該藥材中研究的熱點及主要的質控目標，但中藥的藥效往往是多成分多靶點共同作用的結果，因此關注除生物堿以外的多種活性成分也是中藥質量控制的重要方向。本試驗建立了鉤藤飲片3種成分的一測多評法，同時檢測兒茶素、原花青素B2和表兒茶素。原花青素B2類成分屬于縮合鞣質類成分，高溫和光照易分解,穩定性較差，因此該類成分的對照品制備有較高的難度和局限性，外標法對該類成分的測定中往往因對照品供應等問題，實施難度較高?？紤]到原花青素B2穩定性差，純化難度高，對照品不易得等實際問題，而兒茶素對照品廉價易得且在鉤藤飲片中含量較高，因此本試驗中選擇兒茶素為內參，采用一測多評法可對鉤藤飲片中的縮合鞣質以及其基本組成單元兒茶素和表兒茶素進行同時測定。

本試驗旨在建立較為方便且實用的一測多評的方法對鉤藤飲片的黃烷類成分進行測定，在建立方法的過程中選用了最接近臨床和使用方便的藥房飲片，共選取了 3 個產地，通過本試驗建立的方法希望可以在將來鉤藤藥材的全產業鏈的質量控制和評估中發揮相應作用。