GC-MS法測(cè)定頭孢泊肟酯中的氯甲烷和氯乙烷

白青山，田朋鑫

(臨沂市檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 臨沂 276000)

頭孢泊肟酯是第3代口服頭孢菌素,對(duì)成人和兒童的各種細(xì)菌性感染疾病均有較好療效[1-2]。頭孢泊肟酯生產(chǎn)過(guò)程中使用了甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑，可能會(huì)與工藝中使用的鹽酸反應(yīng)生成基因毒性雜質(zhì)氯甲烷和氯乙烷。該類雜質(zhì)的反應(yīng)活性很活潑，可以直接與DNA發(fā)生烷基化反應(yīng)[3]，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，啟動(dòng)程序性細(xì)胞凋亡[4-5]。此類雜質(zhì)雖微量，但依然可能產(chǎn)生致癌風(fēng)險(xiǎn)，因此需要嚴(yán)格控制[6-7]。目前關(guān)于頭孢泊肟酯的含量測(cè)定、有關(guān)物質(zhì)以及溶劑殘留的研究已有較多文獻(xiàn)報(bào)道[8-11]，但尚未有針對(duì)頭孢泊肟酯中氯甲烷和氯乙烷測(cè)定的研究。因此，探索頭孢泊肟酯中氯甲烷和氯乙烷的定量分析方法是對(duì)其檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)一步完善探討。本文旨在建立一種操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高的頭孢泊肟酯中氯甲烷和氯乙烷的測(cè)定方法，為其用藥安全及相關(guān)研究提供一個(gè)新的思路和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(島津公司)，配QP2010PLUS質(zhì)譜檢測(cè)器，GCMS Solution工作站。

1.2 試劑 氯甲烷對(duì)照品(TCI，批號(hào)：U3VTF，含量：5.6%,W/W)；氯乙烷對(duì)照品(TCI，批號(hào)：8GAYA，含量：15.1%，W/W)；氯丙烷對(duì)照品(TCI，批號(hào)：62R4N-GA，含量：99.0%)；N,N-二甲基甲酰胺(色譜級(jí)，上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?；頭孢泊肟酯(SR有限公司，批號(hào)：1902028001、1903028001、1903028002)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜-質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 (6%-氰丙基苯基)-94%甲基聚硅氧烷為固定液(MEGA，MEGA-624MS，60 m×0.25 mm，1.4 μm)的毛細(xì)管柱；程序升溫過(guò)程：初始柱溫為40 ℃維持9 min，以50 ℃·min-1速率升溫至230 ℃，維持7 min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；載氣為氦氣；流速為線速度模式，柱流速2 mL·min-1；分流進(jìn)樣，分流比10∶1；頂空瓶平衡溫度80 ℃，定量環(huán)溫度110 ℃，傳輸管線溫度120 ℃，平衡時(shí)間25 min。

2.1.2 質(zhì)譜條件 采用電子轟擊電離源(EI)，離子源溫度：200 ℃，接口溫度：200 ℃，檢測(cè)離子(m/z)為50、64、78。

2.2 溶液配制

2.2.1 氯甲烷、氯乙烷貯備溶液 精密量取氯甲烷、氯乙烷對(duì)照品各1 mL置500 mL量瓶中，用50% N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液溶解并定量稀釋至刻度，搖勻；精密量取25 mL置100 mL量瓶中，用50%DMF溶液定量稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)貯備溶液 精密稱取氯丙烷對(duì)照品104.58 mg，置25 mL量瓶中，用50%DMF溶液溶解并定量稀釋至刻度，搖勻；精密量取2 mL置50 mL量瓶中，用50%DMF溶液定量稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 內(nèi)標(biāo)溶液 精密量取內(nèi)標(biāo)貯備溶液5 mL置100 mL量瓶中，用50% N,N-二甲基甲酰胺溶液定量稀釋至刻度，搖勻。

2.2.4 對(duì)照品溶液 精密量取氯甲烷、氯乙烷貯備溶液3 mL置100 mL量瓶中，加內(nèi)標(biāo)貯備溶液5 mL，用50%DMF溶液定量稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.5 供試品溶液 取頭孢泊肟酯原料約15 mg(以頭孢泊肟計(jì))，精密稱定，置20 mL頂空瓶中，加入內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，立即加蓋密封，輕輕振搖溶解，搖勻，即得。

2.2.6 供試品混合溶液 取頭孢泊肟酯原料約15 mg(以頭孢泊肟計(jì))，精密稱定，置20 mL頂空瓶中，加入對(duì)照品溶液1 mL，立即加蓋密封，輕輕振搖溶解，搖勻，即得。

2.3 專屬性試驗(yàn) 精密量取50%DMF溶液1 mL，置20 mL頂空瓶中，立即加蓋密封，作為專屬性空白溶劑。取空白溶劑、定位溶液、內(nèi)標(biāo)溶液、供試品溶液、供試品混合溶液依次頂空進(jìn)樣，記錄色譜圖，氯甲烷、氯乙烷、氯丙烷保留時(shí)間分別為3.472、4.573、5.972 min；供試品混合溶液(見(jiàn)圖 1)中各組分分離度良好，專屬性符合可接受標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 供試品混合溶液的GC-MS圖

2.4 線性關(guān)系試驗(yàn) 線性關(guān)系試驗(yàn)溶液：分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下的氯甲烷、氯乙烷貯備溶液1、2、3、4、5 mL置100 mL量瓶中，各加入5 mL“2.2.2”項(xiàng)下的內(nèi)標(biāo)貯備溶液，用50%DMF溶液定量稀釋至刻度，搖勻；分別精密量取各溶液1 mL置20 mL頂空瓶中，立即加蓋密封，即得線性關(guān)系試驗(yàn)溶液1、2、3、4、5。

取上述溶液分別頂空進(jìn)樣，以待測(cè)物濃度C(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，以氯甲烷峰和氯乙烷峰與內(nèi)標(biāo)峰峰面積的比值為縱坐標(biāo)，作圖，氯甲烷和氯乙烷標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程分別為Y=0.384 5C+0.004 865，r=0.999 1；Y=1.038C-0.001 799，r=0.999 7。該結(jié)果表明氯甲烷和氯乙烷分別在0.252 5～1.263 μg·mL-1和0.645 1～3.226 μg·mL-1范圍內(nèi)濃度與峰面積比值成良好的線性關(guān)系。

2.5 檢測(cè)限及定量限 取氯甲烷、氯乙烷對(duì)照品適量，加50%DMF溶液溶解并稀釋至所需濃度，依法測(cè)定，檢測(cè)限以信噪比S/N為2～3計(jì)；定量限以信噪比S/N為10計(jì)；定量限溶液連續(xù)測(cè)定6次，檢測(cè)限溶液測(cè)定1次。通過(guò)試驗(yàn)確定氯甲烷定量限濃度為0.040 40 ng·mL-1，檢測(cè)限濃度為0.016 16 ng·mL-1；氯乙烷定量限濃度為0.103 2 ng·mL-1，檢測(cè)限濃度為0.041 29 ng·mL-1。氯甲烷定量限保留時(shí)間RSD為0.04%，峰面積RSD為3.2%；氯乙烷定量限保留時(shí)間RSD為0.05%，峰面積RSD為5.2%。

2.6 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 準(zhǔn)確度貯備溶液：分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下的氯甲烷、氯乙烷貯備溶液1、3、4.5 mL置100 mL量瓶中，各加入5 mL“2.2.2”項(xiàng)下的內(nèi)標(biāo)貯備溶液，用50%DMF溶液定量稀釋至刻度，搖勻，即得準(zhǔn)確度貯備溶液#1、#2、#3。

準(zhǔn)確度供試品溶液：取頭孢泊肟酯原料12份，每份約15 mg(以頭孢泊肟計(jì))，精密稱定，置12個(gè)20 mL頂空瓶中，其中3份各加入 “2.2.3”項(xiàng)下的內(nèi)標(biāo)溶液1 mL溶解，作為空白供試品溶液，空白供試品溶液中未檢出氯甲烷和氯乙烷。其余的9份樣品分3組，每組各3份，分別加準(zhǔn)確度貯備溶液#1、#2、#3 1 mL溶解，依次進(jìn)樣測(cè)定，用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算加樣回收率，氯甲烷和氯乙烷的回收率均在 80%～115%之間，符合可接受標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果見(jiàn)表1～2。

表1 氯甲烷準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

表2 氯乙烷準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.7 系統(tǒng)精密度試驗(yàn) 取“2.4”項(xiàng)下線性關(guān)系溶液3頂空進(jìn)樣，記錄色譜圖，連續(xù)測(cè)定6次，計(jì)算氯甲烷峰和氯乙烷峰與內(nèi)標(biāo)峰峰面積的比值的RSD，結(jié)果氯甲烷響應(yīng)值RSD為0.7%，氯乙烷響應(yīng)值RSD為0.6%，表明精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取頭孢泊肟酯原料，按照“2.2.7”項(xiàng)下供試品混合溶液的制備方法平行制備6份，依法測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果氯甲烷回收率平均值為98.6%，RSD為2.4%；氯乙烷回收率平均值為100.2%，RSD為0.9%，表明重復(fù)性良好。

2.9 樣品檢測(cè) 取3批頭孢泊肟酯原料，按“2.2.6”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，依法檢測(cè)，結(jié)果均未檢出氯甲烷和氯乙烷。

3 討論與結(jié)論

3.1 頂空條件的選擇 取“2.2.5”項(xiàng)下的定位溶液于頂空溫度78、80、82 ℃，頂空時(shí)間20、25、30 min下進(jìn)行頂空條件考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氯甲烷、氯乙烷在頂空溫度78、80、82 ℃，頂空時(shí)間20、25、30 min與內(nèi)標(biāo)溶液的峰面積比值均相差不大，故選擇頂空溫度80 ℃，頂空時(shí)間25 min。

3.2 限度的制定 頭孢泊肟酯屬于抗感染治療用藥物，其藥品說(shuō)明書中規(guī)定的每日最大使用劑量為0.8 g，ICH 2017年3月發(fā)布的M7(R1)指導(dǎo)原則《評(píng)估和控制藥物中DNA反應(yīng)性(突變性)雜質(zhì)以限制潛在致癌風(fēng)險(xiǎn)》中氯甲烷、氯乙烷的TD50值分別為每天1 361、1 810 mg·kg-1[12],通過(guò)計(jì)算可得每日允許暴露量PDE值分別為每天1 361、1 810 μg。根據(jù)ICH Q3A(R2)中對(duì)于雜質(zhì)限度的規(guī)定，我們初步將頭孢泊肟酯原料藥及其制劑中氯甲烷、氯乙烷的限度值定為0.1%。

藥品中的很多雜質(zhì)都能夠產(chǎn)生毒副作用，尤其是基因毒性雜質(zhì)，極少的暴露量就能夠?qū)θ梭w健康產(chǎn)生嚴(yán)重的危害[12]。頭孢泊肟酯原料藥在《中國(guó)藥典》中有收載，但未見(jiàn)對(duì)氯甲烷和氯乙烷的控制，本文建立的GC-MS法分析速度快、靈敏度高、定量準(zhǔn)確，適合頭孢泊肟酯原料藥中氯甲烷和氯乙烷的測(cè)定，該研究為頭孢泊肟酯的質(zhì)量?jī)?yōu)化提供了參考依據(jù)。