左旋含羞草堿通過調控LATS1表達對結直腸癌細胞增殖及凋亡的影響

李永慧 王倩林 賈笑強 劉明成

(西寧市第一醫療集團總院消化內科, 青海 西寧 810000)

結直腸癌是消化道中常見的惡性腫瘤之一，其早期難以發現導致發病率和死亡率較高[1-4]。研究表明藥物治療在結直腸癌治療中發揮著重要作用，臨床上中藥常用于放化療及手術輔助治療結腸癌患者，不僅可以增強化療效果，還可減輕化療的毒副反應，降低結直腸癌復發及轉移，對提高患者生存質量具有較好療效[5-7]。因此，開發新的抗結直腸癌藥物對其臨床治療具有重要意義。左旋含羞草堿是從豆科含羞草屬植物中提取的植物氨基酸，研究報道左旋含羞草堿可以有效抑制骨肉瘤細胞增殖并誘導骨肉瘤細胞凋亡[8]，還可抑制頭頸鱗狀細胞癌細胞增殖并誘導其凋亡[9]。然而左旋含羞草堿對結直腸癌細胞增殖、凋亡的影響及其機制尚不清楚。大腫瘤抑制基因1(large tumor suppressor gene 1，LATS1)是Hippo信號通路中的重要激酶的關鍵組分之一，其具有抑制腫瘤發生和發展的作用[10]。研究報道結直腸癌組織中LATS1 mRNA低表達，抑制LATS1的表達可促進結腸癌細胞的增殖，侵襲和遷移[11]。此外，LATS1在食管鱗癌組織中也低表達，過表達LATS1可抑制細胞增殖、遷移和侵襲，同時能夠促進細胞凋亡[12]。研究報道蟲草素可上調LATS1表達，通過激活Hippo信號通路抑制宮頸癌細胞增殖，促進凋亡[13]。因此，本實驗旨在研究左旋含羞草堿是否通過調控LATS1影響結直腸癌細胞的增殖、凋亡。

1 材料與方法

1.1 材料 結直腸癌細胞株SW480(上海遠慕生物科技有限公司)，RPMI-1640培養基(武漢益普生物科技有限公司)，左旋含羞草堿(上海甄準生物科技有限公司)，MTT試劑盒(美國sciencell公司)，RIPA蛋白裂解液、二辛可寧酸(BCA)試劑盒(上海源葉生物科技有限公司)，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(江西江藍純生物試劑有限公司)，實時熒光定量PCR試劑盒(北京拜爾迪生物技術有限公司)。

1.2 細胞處理與分組 結直腸癌細胞SW480用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基培養，取對數生長期細胞SW480，分別用終濃度為100、200、400 μM的左旋含羞草堿處理，記為左旋含羞草堿低、中、高濃度組，正常培養的細胞作為對照組；將pcDNA、pcDNA-LATS1轉染至SW480細胞中，記為pcDNA組、pcDNA-LATS1組；將si-NC、si-LATS1轉染至SW480細胞后用400 μM的左旋含羞草堿處理，記為左旋含羞草堿+si-NC組、左旋含羞草堿+si-LATS1組。

1.3 MTT檢測細胞增殖抑制率 收集各組細胞，按試劑盒說明操作，用酶標儀檢測490 nm吸光度(OD)值。細胞增殖抑制率(%)=(1-OD實驗組值/OD空白對照組值)×100%。

1.4 蛋白質印跡(Western blot)法檢測CyclinD1、p21、Bcl-2、Bax、LATS1蛋白表達水平 提取細胞總蛋白，對蛋白樣品定量，然后進行電泳，接著轉至PVDF膜，封閉后加入一抗，在4 ℃條件下孵育過夜，然后加入二抗孵育2 h，再用ECL發光液顯影，成像后檢測蛋白條帶灰度值，以目的條帶和GAPDH的比值作為相對表達水平。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組細胞，漂洗后按試劑盒說明操作，然后上流式細胞儀檢測，計算細胞凋亡率。

1.6 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測LATS1 mRNA的表達水平 提取各組細胞總RNA，合成cDNA，按照試劑盒說明進行PCR，相對表達量用2-ΔΔCt法計算。LATS1以GAPDH為內參，LATS1上游引物序列：5′-GAAACAAATTCTTCTCGGAGTACT TC-3′，下游引物序列：5′-CTTCTGTTGTTAGTTTT CTGAAGAGC-3′；GAPDH上游引物序列：5′-TGT TGCCATCAATCACCCCTT-3′，下游引物序列：5′-CTCCACGACGTACTCAGCG-3′。

2 結果

2.1 左旋含羞草堿對結直腸癌SW480細胞增殖的影響 與對照組比較，左旋含羞草堿-低、中、高濃度組SW480細胞增殖抑制率升高，SW480細胞中CyclinD1的表達水平降低，p21表達水平升高，且呈濃度依賴性(P<0.05)，見圖1、表1。

圖1 增殖相關蛋白表達

表1 左旋含羞草堿對結直腸癌SW480細胞增殖的影響

2.2 左旋含羞草堿對結直腸癌SW480細胞凋亡的影響 與對照組比較，左旋含羞草堿低、中、高濃度組SW480細胞凋亡率升高，SW480細胞中Bcl-2表達水平降低，Bax表達水平升高，且呈濃度依賴性(P<0.05)，見圖2、表2。

表2 左旋含羞草堿對結直腸癌SW480細胞凋亡的影響

圖2 左旋含羞草堿對結直腸癌SW480細胞凋亡的影響

2.3 左旋含羞草堿對結直腸癌SW480細胞中LATS1表達的影響 與對照組比較，左旋含羞草堿-低、中、高濃度組SW480細胞中LATS1 mRNA和蛋白表達水平升高，且呈濃度依賴性(P<0.05)，見圖3、表3。

圖3 LAST1蛋白表達

表3 左旋含羞草堿對結直腸癌SW480細胞中LATS1表達的影響

2.4 LATS1過表達對結直腸癌SW480細胞增殖和凋亡的影響 與pcDNA組比較，pcDNA-LATS1組SW480細胞中LATS1表達水平升高，SW480細胞增殖抑制率升高，SW480細胞凋亡率升高，SW480細胞中CyclinD1、Bcl-2蛋白的相對表達水平降低，p21、Bax蛋白的相對表達水平升高(P<0.05)，見圖4、表4。

表4 LATS1過表達對結直腸癌SW480細胞增殖和凋亡的影響

圖4 LATS1和增殖、凋亡相關蛋白表達

2.5 抑制LATS1表達逆轉了左旋含羞草堿(400 μM)對結直腸癌SW480細胞增殖和凋亡的作用與左旋含羞草堿+si-NC組比較，左旋含羞草堿+si-LATS1組SW480細胞中LATS1表達水平降低，SW480細胞增殖抑制率降低，SW480細胞凋亡率降低，SW480細胞中CyclinD1、Bcl-2蛋白的相對表達水平升高，而p21、Bax蛋白的相對表達水平降低(P<0.05)，見圖5、表5。

表5 抑制LATS1表達逆轉了左旋含羞草堿對結直腸癌SW480細胞增殖和凋亡的作用

圖5 LATS1和增殖、凋亡相關蛋白表達

3 討論

結直腸癌是發病率和病死率較高的惡性腫瘤，中醫藥治療在結直腸癌綜合治療中占有重要地位，從中藥中尋找預防和治療結直腸癌的有效成分，并研究其作用機制成為當前結直腸癌研究的熱點[14-17]。研究報道番茄堿能通過抑制HCT116細胞的增殖與轉移，促進細胞凋亡[18]。苦參堿抑制結直腸癌細胞增殖和侵襲，并增加細胞凋亡[19]。研究發現左旋含羞草堿可抑制PC-3和LNCaP前列腺癌細胞的增殖[20]，且左旋含羞草堿可誘導caspase-9介導的骨肉瘤細胞凋亡，從而抑制細胞增殖[21]。為研究左旋含羞草堿對結直腸癌細胞的影響，本實驗用不同濃度的左旋含羞草堿處理結直腸癌細胞SW480，結果顯示，SW480細胞增殖抑制率升高，SW480細胞凋亡率升高，且呈濃度依賴性。表明左旋含羞草堿可劑量依賴的抑制結直腸癌細胞SW480增殖、促進細胞凋亡。

研究報道LATS1在宮頸癌組織中下調表達，過表達LAST1可抑制宮頸癌細胞的增殖和侵襲[22]。LATS1可通過下調Yes相關蛋白(Yes-associated protein，YAP)的表達水平促進A549細胞的凋亡，誘導G1期阻滯，降低細胞的增殖能力[23]。LMO3通過直接與LATS1相互作用并抑制Hippo信號傳導來促進肝細胞癌的侵襲、轉移[24]。本實驗結果顯示，過表達LATS1后，SW480細胞的增殖抑制率和凋亡率升高，表明過表達LATS1可抑制結直腸癌細胞增殖，并促進細胞凋亡。本實驗還發現左旋含羞草堿可提高LATS1的表達水平，而抑制LATS1表達逆轉了左旋含羞草堿對結直腸癌SW480細胞增殖和凋亡的作用。

4 結論

本研究結果顯示，左旋含羞草堿可通過上調LATS1表達抑制結直腸癌細胞增殖，并促進細胞凋亡。