白芍總苷對(duì)母嬰分離小鼠行為學(xué)與相關(guān)腦區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的影響?

梁 媛， 苗 襄， 高靜靜， 岳廣欣△， 岳利峰

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所， 北京 100700；2.莆田市中醫(yī)醫(yī)院，福建 莆田 351100；3.開封市中醫(yī)院，河南 開封 475000；4.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院， 北京 100700)

早年不良應(yīng)激屬于慢性心理應(yīng)激(chronic psychological stress，CPS)的一種，兒童時(shí)期受到創(chuàng)傷、虐待和忽視的經(jīng)歷與其成年后罹患精神疾患的風(fēng)險(xiǎn)增加密切相關(guān)，且已被證明會(huì)導(dǎo)致嚙齒類、靈長(zhǎng)類動(dòng)物和人類的各種行為缺陷[1-2]。母嬰分離動(dòng)物模型是早年應(yīng)激對(duì)個(gè)體生理、病理造成不良影響的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制研究的重要工具。前期工作發(fā)現(xiàn)，母嬰分離小鼠成年后更容易表現(xiàn)出抑郁、焦慮樣行為，如在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)開放臂活動(dòng)減少、強(qiáng)迫游泳與鼠尾懸掛實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間明顯延長(zhǎng)等[3-6]，但其具體的作用機(jī)制尚不清楚。近年來(lái)研究提示，炎癥免疫反應(yīng)參與其中[7]。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的固有免疫細(xì)胞，隨著對(duì)其功能研究的不斷深入發(fā)現(xiàn)，其在精神障礙類疾患的發(fā)病中起著越來(lái)越重要作用[8-9]。

白芍( Radix Paeonia Alba) 為毛莨科植物芍藥(Paeonialactiflora Pall．)的干燥根，性微寒，味苦酸，歸肝、脾經(jīng)，具有養(yǎng)血斂陰、平抑肝陽(yáng)、柔肝止痛之功[10]。其有效成分主要是一組苷類，包括芍藥苷、白芍苷 R1、芍藥新苷、氧化芍藥苷、羥基芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷等，總稱為白芍總苷(total glycosides of paeony ,TGP)[11-12]，并具有補(bǔ)血、降壓、抗炎、鎮(zhèn)痛等多重藥理作用[13-15]。近期有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，TGP在慢性應(yīng)激小鼠模型中能夠發(fā)揮一定的抗抑郁作用[16]。本實(shí)驗(yàn)建立母嬰分離模型小鼠，在其生長(zhǎng)至P90～P120時(shí)以TGP進(jìn)行4周的干預(yù)，通過(guò)曠場(chǎng)及社會(huì)交互行為實(shí)驗(yàn)觀察4周后小鼠行為模式的變化，免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物離子鈣接頭蛋白 (ionized calcium-binding adaptor molecule，Iba) -1的表達(dá)，研究TGP對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞功能狀態(tài)的影響，以期進(jìn)一步探討TGP的免疫與抗炎作用及其對(duì)早年心理應(yīng)激造成成年后抑郁易感性的可能作用機(jī)制。本研究已通過(guò)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)2019-003。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6J小鼠60只，雌鼠48只，雄鼠12只，體質(zhì)量19～26 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京)2019-0012，置于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所清潔級(jí)動(dòng)物房常規(guī)飼養(yǎng)，室溫22 ℃，相對(duì)濕度30%～40%，12 h光/暗周期，自由進(jìn)食和飲水。

1.2 主要藥物與試劑

白芍總苷膠囊(規(guī)格0.3 g×36粒，批號(hào)160803)，朗生醫(yī)藥有限公司；包埋劑(ZLI-9302)，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；TritonX-100(H5142)，Promega；正常兔血清(ZLI-9026)、抗體稀釋液(2LI-9029)、兔抗山羊lgG/生物素標(biāo)記(ZB-2050)，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Anti-Iba-1antibody(ab5076；abcam)、Elite ABC試劑盒(PK-6100，VECTASTAIN)、DAB(D5637-5G)，sigma公司。

1.3 母嬰分離

選用24 g 以上成年C57BL/6J小鼠進(jìn)行繁殖，將小鼠按雌雄=4∶1雌雄混居，孕鼠待產(chǎn)前單籠飼養(yǎng)，分娩后每窩仔鼠保持在4～7 只，以小鼠出生作為0 天(P0)，分別于P5～P14 進(jìn)行母嬰分離，即先將母鼠移至新籠，再將仔鼠移至孵育箱(32 ℃)，每只仔鼠放在獨(dú)立的小盒中進(jìn)行分離，每天分離8 h。

1.4 動(dòng)物分組及給藥

選用出生后P90～P120的 C57BL/6J雄性小鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。先將未經(jīng)過(guò)母嬰分離且月齡相當(dāng)?shù)?0只小鼠作為正常組，再將經(jīng)過(guò)母嬰分離的10只小鼠分成母嬰分離組和TGP組8只。參照說(shuō)明書，TGP的用藥量按0.5 mg/10 g體質(zhì)量計(jì)算。每粒膠囊重0.3 g，含104 mg TGP活性成分，1只實(shí)驗(yàn)鼠(20 g)1d的用藥量為1.0 mg，8只小鼠28 d總用藥量224 mg，換算成TGP膠囊即為646 mg。將646 mg TGP膠囊溶于雙蒸水中定容至896 ml，按每只小鼠日采食量4 g計(jì)算，將896 g粉碎飼料與上述藥水混合均勻(藥水與飼料=1∶1)。將混合好的飼料用簡(jiǎn)易面條機(jī)壓縮成條狀，在烤箱中烘烤8 h，干燥冷卻后含藥飼料即準(zhǔn)備就緒。為防止灌胃造成的應(yīng)激與損耗，TGP組小鼠每天給予一定量的TGP含藥飼料進(jìn)行干預(yù)，共喂養(yǎng)28 d。正常組和母嬰分離組在此期間分別喂飼正常飼料。

1.5 行為學(xué)檢測(cè)

行為學(xué)檢測(cè)均在藥物干預(yù)4周后開始，具體操作如下。

1.5.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 小鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室15 min后，放入曠場(chǎng)箱(40 cm×40 cm)中心點(diǎn)，設(shè)中心點(diǎn)附近20×20 cm區(qū)域?yàn)橹醒雲(yún)^(qū)，記錄30 min小鼠運(yùn)動(dòng)總路程(total distance of movement)和中心區(qū)活動(dòng)時(shí)間(central area activity time)。

1.5.2 社會(huì)交互實(shí)驗(yàn) 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后第2天進(jìn)行社會(huì)交互實(shí)驗(yàn)步驟如下[17]：①實(shí)驗(yàn)鼠放于與原籠一樣的鼠籠中適應(yīng)15 min，實(shí)驗(yàn)開始前先將1只同種屬同性別的小鼠放置在6×8×10 cm 的金屬網(wǎng)籠中，再將金屬網(wǎng)籠貼壁放在40×40 cm 的曠場(chǎng)箱的一側(cè)箱壁正中，隨即將實(shí)驗(yàn)鼠放至?xí)鐖?chǎng)箱的對(duì)側(cè)箱壁中點(diǎn)，將金屬網(wǎng)籠周圍25×20 cm區(qū)域設(shè)置為接觸區(qū)，接觸區(qū)對(duì)側(cè)的2個(gè)13 cm×13 cm角落為遠(yuǎn)角區(qū)，記錄5 min 內(nèi)實(shí)驗(yàn)鼠進(jìn)入接觸區(qū)的時(shí)間；②間隔35 min 后，再將實(shí)驗(yàn)鼠放入同樣的曠場(chǎng)箱中，接觸同一只同性別的接觸鼠，再次記錄測(cè)試實(shí)驗(yàn)鼠進(jìn)入接觸區(qū)的時(shí)間；③進(jìn)入遠(yuǎn)角區(qū)時(shí)間為遠(yuǎn)角停留時(shí)間(distant residence time)，第1 次測(cè)試進(jìn)入接觸區(qū)時(shí)間為訓(xùn)練探查時(shí)間(training exploration time),第2 次測(cè)試進(jìn)入接觸區(qū)時(shí)間為辨別探查時(shí)間(discrimination exploration time)。

1.6 免疫組化染色

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組小鼠用1%戊巴比妥鈉腹腔注射進(jìn)行深度麻醉(100 mg/kg體質(zhì)量)，繼之用4%多聚甲醛溶液灌注，取腦后固定12 h(4 ℃保存)，置于30%蔗糖溶液中脫水(4 ℃保存)，待組織下沉后恒冷低溫切片(30 μm)。切片置于24孔板中平衡30 min，通過(guò)漂浮法進(jìn)行免疫組化染色，用抗體稀釋液稀釋一抗(Iba-1稀釋度為1∶1000)，4 ℃孵育18 h；生物素化的二抗(1∶250)室溫?fù)u床孵育4 h；Elite ABC(1:25，用1×PBS稀釋)，室溫?fù)u床90 min；0.05%DAB顯色，以上步驟皆用1×PBS充分漂洗，將切片貼于載玻片上，干燥后脫水、透明、封片、拍攝。選用每組冠狀面相似并帶有海馬的切片，利用AperioCS2數(shù)字病理切片掃描系統(tǒng)掃描腦組織切片，用Image Scope在20×放大倍數(shù)下截取CA1區(qū)、CA3區(qū)、下丘腦圖像，圖像大小為1264×697，每組20張切片，利用image pro Plus 6分析并計(jì)算陽(yáng)性產(chǎn)物的IOD值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1示，與正常組比較，母嬰分離組小鼠30 min運(yùn)動(dòng)總距離明顯增加 (P<0.05) ，TGP可明顯縮短小鼠的運(yùn)動(dòng)總距離(P<0.05)，3組小鼠中心區(qū)停留時(shí)間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

注：A：曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(Open field test)中心區(qū)停留時(shí)間(time in center zone)，B：曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)30 min運(yùn)動(dòng)總距離(total distance in 30 min)；結(jié)果以表示；NC:對(duì)照組，n=10；MS:母嬰分離組，n=10；TGP:TGP治療組，n=8。與NC組比較:*P<0.05；與MS組比較:##P<0.01

2.2 社會(huì)交互實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2示，與正常組比較，母嬰分離組小鼠的訓(xùn)練探查時(shí)間增加，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，辨別探查時(shí)間明顯增加且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；白芍總苷組可明顯縮短母嬰分離小鼠的訓(xùn)練探查時(shí)間(P<0.05)和辨別探查時(shí)間(P<0.01)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2次試驗(yàn)中，3組小鼠之間的遠(yuǎn)角停留時(shí)間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

注：社會(huì)交互實(shí)驗(yàn)(social interaction test)A：訓(xùn)練探查時(shí)間(training exploration time)，B：辨別探查時(shí)間(discrimination exploration time)，C：第1次遠(yuǎn)角停留時(shí)間(distant residence time in training trial)，D：第2次遠(yuǎn)角停留時(shí)間(distant residence time in adaptation trial)；結(jié)果以表示；NC:對(duì)照組，n=10；MS:母嬰分離組，n=10；TGP:TGP治療組，n=8。與NC組比較:*P<0.05;與MS組比較:#P<0.05，##P<0.01

2.3 免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖3、4與圖5示，與正常組比較，母嬰分離組小鼠的Iba-1陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物IOD值在海馬CA1區(qū)、海馬CA3區(qū)及下丘腦均顯著增加(P<0.01)，且母嬰分離組小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞胞體明顯變大，突起回縮；TGP組與母嬰分離組比較，Iba-1陽(yáng)性表達(dá)IOD值均顯著降低(P<0.01)，且胞體明顯變小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

注：NC：對(duì)照組，n=6；MS：母嬰分離組，n=6；TGP：TGP治療組，n=6。A-F為免疫組化染色圖：(A和B)NC組，(C和D)MS組，(E和F)TGP組；A、 C和E，放大倍數(shù)×20，比例尺，500 μm；B、D和F：放大倍數(shù)×100，比例尺，200 μm；B、D和F中的箭頭表示Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞；(G)各組大鼠海馬CA1區(qū)Iba-1的IOD值；與NC組比較：**P<0.01，與MS組比較：##P<0.01

注：NC：對(duì)照組，n=6；MS：母嬰分離組，n=6；TGP：TGP治療組，n=6。HM為免疫組化染色圖：(H和I)NC組，(J和K)MS組，(L和M)TGP組；H、J和L，放大倍數(shù)×20，比例尺，500 μm；I、K和M：放大倍數(shù)×100，比例尺，200 μm；I、K和M中的箭頭表示Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞；(N)各組大鼠海馬CA3區(qū)Iba-1的IOD值；與NC組比較：**P<0.01，與MS組比較：##P<0.01

注：NC：對(duì)照組，n=6；MS：母嬰分離組，n=6；TGP：TGP治療組，n=6。OT為免疫組化染色圖：(O和P)NC組，(Q和R)MS組，(S和T)TGP組；O、Q和S，放大倍數(shù)x20，比例尺，500 μm；P、R和T：放大倍數(shù)×100，比例尺，200μm；P、R和T中的箭頭表示Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞；(N)各組大鼠海馬下丘腦區(qū)Iba-1的IOD值；與NC組比較：**P<0.01，與MS組比較：##P<0.01

3 討論

TGP是從芍藥根中提取的有效成分，能夠減輕多種疾病的免疫反應(yīng)[18]。本研究結(jié)果顯示，口服TGP能夠有效調(diào)節(jié)母嬰分離模型小鼠的行為并改善其相關(guān)腦區(qū)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化。

在30 min的曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，MS(8 h)小鼠與正常組小鼠相比運(yùn)動(dòng)總距離增加，提示動(dòng)物處于多動(dòng)與焦慮的狀態(tài)。社會(huì)交互實(shí)驗(yàn)中，MS小鼠在第1次和第2次接觸未知個(gè)體時(shí)都表現(xiàn)出比對(duì)照組更長(zhǎng)的探索時(shí)間。據(jù)此推斷當(dāng)MS小鼠長(zhǎng)大后，早期母嬰分離可能改變其在陌生環(huán)境中的行為反應(yīng)，使其在未知區(qū)域與陌生個(gè)體接觸時(shí)無(wú)法正確評(píng)估環(huán)境并及時(shí)規(guī)避可能的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)也意味著，MS小鼠成年后在一定程度上出現(xiàn)認(rèn)知能力的下降，這是抑郁癥的潛在癥狀之一。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期與反復(fù)的MS會(huì)增加小鼠的焦慮樣行為，并提高其成年后的抑郁易感性。有研究顯示，MS(3 h)可使女性的社交能力增強(qiáng)，而男性則完全不受影響，輕度的早年應(yīng)激可能對(duì)個(gè)體的后期行為反應(yīng)有積極的影響，甚至能夠使其在面對(duì)強(qiáng)烈的壓力時(shí)更容易適應(yīng)[19-20]。但長(zhǎng)期MS(超過(guò)4 h)能造成嚙齒類動(dòng)物下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)軸顯著失調(diào)，增加其焦慮、抑郁樣行為。這與本課題組的研究結(jié)果一致[21]。本次研究發(fā)現(xiàn)，TGP對(duì)曠場(chǎng)與社會(huì)交互實(shí)驗(yàn)中模型小鼠異常的行為學(xué)變化起到了顯著的干預(yù)作用。

為探討MS引起行為學(xué)改變的生物學(xué)機(jī)制，本研究通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)了小鼠海馬和下丘腦小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba-1的表達(dá)。小膠質(zhì)細(xì)胞是唯一存在于大腦中的免疫細(xì)胞，它對(duì)外界或內(nèi)部的刺激非常敏感，任何可能破壞中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的微小刺激都會(huì)引起小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。這種激活可表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)及功能狀態(tài)2個(gè)方面，活化后的小膠質(zhì)細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)上表現(xiàn)為胞體增大、凸起回縮[22]，由分枝樣的靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)變成阿米巴蟲樣的活化狀態(tài)[23]；功能狀態(tài)方面，小膠質(zhì)細(xì)胞被迅速活化后開始吞噬與清除凋亡、壞死和受損的神經(jīng)元[24-25]，從而抑制炎癥發(fā)展，但過(guò)度的吞噬作用和免疫反應(yīng)會(huì)使小膠質(zhì)細(xì)胞活化過(guò)度，進(jìn)而釋放出大量的炎性因子、細(xì)胞毒性物質(zhì)等多種介質(zhì)，從而加重炎癥反應(yīng)[26-27]。由小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度激活而導(dǎo)致的神經(jīng)炎癥是引起認(rèn)知能力下降和神經(jīng)元突觸功能異常的最直接原因，而認(rèn)知能力下降是抑郁癥的典型癥狀。多項(xiàng)研究證實(shí)，抑郁癥患者常出現(xiàn)海馬區(qū)體積縮小、下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)軸功能異常等表現(xiàn)[28]。本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MS小鼠的海馬和下丘腦區(qū)域小膠質(zhì)細(xì)胞的胞體明顯增大，陽(yáng)性產(chǎn)物的數(shù)量與密度明顯增加，表明小膠質(zhì)細(xì)胞已被激活。TGP對(duì)激活的小膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的抑制作用。在臨床上TGP已被廣泛應(yīng)用于RA和SLE的治療[29]。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究表明，TGP具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TGP可以呈劑量依賴性地對(duì)抗皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性[30]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，TGP在HPA軸失調(diào)的大鼠中表現(xiàn)出抗抑郁的作用[31]。本研究表明，TGP降低了母嬰分離小鼠海馬和下丘腦腦區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)，提示TGP在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中能夠發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而對(duì)其成年后抑郁易感性產(chǎn)生一定的影響。

TGP是中藥白芍的主要有效成分。《本草綱目》有云：“白芍藥益脾，能于土中瀉木。”數(shù)據(jù)挖掘研究發(fā)現(xiàn)，白芍→當(dāng)歸及白芍→甘草藥對(duì)是治療抑郁方劑的基本藥對(duì)，在抑郁癥治療中具有舉足輕重的地位，也是具有疏肝健脾功效的中藥名方逍遙散的重要組成部分[32]。大量臨床與實(shí)驗(yàn)研究都發(fā)現(xiàn)，逍遙散具有較好的抗抑郁效果，其抗抑郁的藥理成分主要包括芍藥苷和柴胡皂苷等[33]。本研究對(duì)TGP的分子機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，發(fā)現(xiàn)其對(duì)抗免疫激活的作用可能是其干預(yù)MS小鼠成年后抑郁易感性的可能機(jī)制之一，這在一定程度上證實(shí)炎癥與抑郁的密切關(guān)系，與中藥能通過(guò)多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮綜合效應(yīng)的作用特點(diǎn)。總之，TGP可能成為治療抑郁癥的潛在藥物，今后課題組將繼續(xù)進(jìn)行相關(guān)研究。