穴位埋線對(duì)變應(yīng)性鼻炎大鼠炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子及JNK通路的調(diào)節(jié)作用?

鄭曉娟， 張艷梅， 王曉燕

(河南中醫(yī)藥大學(xué)鄭州市中醫(yī)院， 鄭州 450000)

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是臨床常見的變態(tài)反應(yīng)性疾病，其病因是機(jī)體接觸過敏原后免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)大量釋放并介導(dǎo)鼻黏膜中炎癥反應(yīng)激活[1]，IgE釋放后與其受體結(jié)合后能夠促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白(eotaxin)釋放，引起多種細(xì)胞因子分泌異常，進(jìn)而引起鼻黏膜發(fā)生病理改變，同時(shí)也加重鼻黏膜中體液免疫應(yīng)答的紊亂[2-3]。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun amino-terminal kinase，JNK)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族中的重要成員之一。該通路的激活參與哮喘、AR等多種過敏性疾病的發(fā)病。

AR屬于中醫(yī)“鼻鼽”范疇，該病氣陽虛衰為本、外感風(fēng)邪為標(biāo)，治療應(yīng)以升陽益氣、健脾益氣為主[4-5]。穴位埋線是以針灸經(jīng)絡(luò)理論為指導(dǎo)的中醫(yī)治療手段。已有研究報(bào)道，選取百會(huì)、肺俞、脾俞3個(gè)穴位進(jìn)行埋線是治療AR的有效手段[6-7]。為闡明穴位埋線治療AR的機(jī)制，本研究以AR模型大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，觀察了穴位埋線對(duì)AR大鼠炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子及JNK通路的影響，旨在進(jìn)一步明確穴位埋線治療AR的作用，并探討介導(dǎo)這一作用的分子機(jī)制，為穴位埋線臨床治療AR提供理論基礎(chǔ)。本研究已通過河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查，批號(hào)V20200908。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠，6～8周齡，體質(zhì)量140～200 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(滬)2017-0005，飼養(yǎng)在河南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心，溫度18～25 ℃，適度50%～60%，自由光照。

1.2 試劑與儀器

卵清蛋白(貨號(hào)O1641、5 mg/支)，Sigma公司；氫氧化鋁(貨號(hào)A800852、500 g/瓶)，上海麥克林生化科技有限公司；丙酸倍氯米松(貨號(hào)5534-09-8、1000 g/瓶 )，武漢澤諾生物科技有限公司；4-0醫(yī)用羊腸線，上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品股份有限公司；HE染色試劑盒(貨號(hào)ZLI-9018)，北京中杉金橋生物公司；IgE(貨號(hào)F15751)、Eotaxin(貨號(hào)F15330)、干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)(貨號(hào)F15730)、白介素(interleukin)-4(貨號(hào)F15850)、IL-5(貨號(hào)F15860)、IL-17(貨號(hào)F15940)酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(ELISA)試劑盒，上海西唐公司；JNK、p-JNK的單克隆一抗(貨號(hào)9252)，CST公司；顯微鏡，日本尼康公司；凝膠成像系統(tǒng)，上海天能公司。

1.3 模型制備與分組

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組和造模組，對(duì)照組共10只，造模組參照田永萍等[7]研究按照下列方法制備AR模型。第1～14天，腹腔注射含有0. 3 mg卵清蛋白及30 mg氫氧化鋁的0.9%氯化鈉溶液1 mL，隔日1次共7次，該階段為致敏階段；第15～21天，用0.9%氯化鈉溶液配置含有2%卵清蛋白的混懸液，雙側(cè)鼻孔各滴入0.05 mL，每日1次，連續(xù)7次，該階段為激發(fā)階段。完成造模后，參照田永萍等[7]研究對(duì)鼻癢、噴嚏、清涕的癥狀進(jìn)行評(píng)分。鼻癢：輕擦鼻幾次為1分，抓撓鼻、面不止，到處摩擦為2分；噴嚏：1～3個(gè)為1分，4～10個(gè)為2分，11個(gè)及以上為3分；清涕：流涕至前鼻孔為1分，流涕過前鼻孔為2分，流涕滿面為3分，總得分超過5分為造模成功。將造模成功的30只大鼠進(jìn)一步隨機(jī)分為模型組、西藥組、埋線組每組各10只，第22天開始對(duì)各組大鼠進(jìn)行干預(yù)共治療4周。

1.4 各組處理方法

西藥組給予丙酸倍氯米松雙側(cè)滴鼻(0.18 mg/kg)，每日1次，連續(xù)4周。埋線組分2階段進(jìn)行穴位埋線治療：第一階段為第1～2周，選擇“百會(huì)”、雙側(cè)“肺俞”穴埋線1次；第二階段為第3～4周，選擇“百會(huì)”“肺俞”“脾俞”穴埋線1次。穴位根據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[8]的大鼠穴位圖譜，“百會(huì)”在頂骨正中，用9號(hào)埋線針向前或后斜刺2 mm；“肺俞”為第三胸椎棘突下兩旁肋間，直刺5 mm，“脾俞”為第十二胸椎下兩旁肋間，直刺5 mm。確定穴位后，對(duì)穴位及周圍皮膚進(jìn)行消毒，用9號(hào)埋線針將4-0羊腸線埋入，埋線長(zhǎng)度約2～3 mm。對(duì)照組及模型組不進(jìn)行特殊處理。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

治療結(jié)束后，腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/kg麻醉后，經(jīng)心臟負(fù)壓采血5～6 mL，離心后收集血清，采用ELISA試劑盒檢測(cè)IgE、Eotaxin、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-17的含量，操作均按照試劑盒說明書進(jìn)行。頸椎脫臼處死大鼠，打開鼻腔并解剖鼻黏膜組織，0.9%氯化鈉溶液清洗后分為兩份，一份用4%多聚甲醛固定后制作石蠟切片，用于HE染色并在顯微鏡下觀察病理改變。另一份用液氮冷凍后加入RIPA裂解液提取蛋白，采用ELISA試劑盒檢測(cè)IgE、Eotaxin、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-17的含量，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。另取組織蛋白適量，蛋白樣本在凝膠電泳系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行電泳、電轉(zhuǎn)硝酸纖維素(NC)膜，5%脫脂牛奶封閉后孵育JNK、p-JNK及β-actin的一抗，4 ℃過夜。次日，孵育HRP二抗，室溫1～2 h，在凝膠成像系統(tǒng)顯影，以β-actin為內(nèi)參，根據(jù)蛋白條帶的灰度值計(jì)算表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠癥狀評(píng)分及鼻黏膜病理切片HE染色比較

表1顯示，模型組大鼠癥狀評(píng)分增加，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。干預(yù)后，西藥組、埋線組大鼠癥狀評(píng)分較干預(yù)前降低，且癥狀評(píng)分低于模型組，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與西藥組比較，埋線組大鼠癥狀評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示西藥及埋線治療干預(yù)均能改善AR癥狀，且西藥與埋線效果相當(dāng)。

表1 各組大鼠癥狀評(píng)分比較

圖1顯示，對(duì)照組大鼠鼻黏膜形態(tài)正常，無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠鼻黏膜可見組織水腫充血明顯，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；西藥組、埋線組大鼠鼻黏膜可見組織水腫充血改善，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，提示模型組大鼠出現(xiàn)了AR相關(guān)的病理改變，穴位埋線及西藥均能夠改善AR的病理改變。

注：箭頭所指為浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞

2.2 各組大鼠血清及鼻黏膜中炎癥介質(zhì)比較

表2示，模型組大鼠血清及鼻黏膜中Eotaxin、IgE含量增加，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。干預(yù)后，西藥組、埋線組大鼠血清及鼻黏膜中Eotaxin、IgE含量降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與西藥組比較，埋線組大鼠血清及鼻黏膜中Eotaxin、IgE含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示西藥及埋線治療干預(yù)均能抑制模型大鼠炎癥介質(zhì)Eotaxin、IgE的分泌，且西藥與埋線的效果相當(dāng)。

表2 各組大鼠血清及鼻黏膜中Eotaxin、IgE含量比較

2.3 各組大鼠血清及鼻黏膜中細(xì)胞因子比較

表3顯示，模型組大鼠血清及鼻黏膜中IFN-γ的含量減少，IL-4、IL-5、IL-17的含量增加，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。干預(yù)后與模型組比較，西藥組、埋線組大鼠血清及鼻黏膜中IFN-γ的含量增加(P<0.01)，IL-4、IL-5、IL-17的含量降低(P<0.01)；與西藥組比較，埋線組大鼠血清及鼻黏膜中IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-17含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示西藥及埋線治療干預(yù)均能調(diào)節(jié)模型大鼠細(xì)胞因子的分泌，且西藥與埋線的效果相當(dāng)。

表3 各組大鼠血清及鼻黏膜中IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-17含量比較

2.4 各組大鼠鼻黏膜中p-JNK、JNK表達(dá)的比較

圖2表4顯示，各組間JNK的表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型組大鼠鼻黏膜中p-JNK的表達(dá)水平增加，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。干預(yù)后與模型組比較，西藥組鼻黏膜中p-JNK的表達(dá)水平無明顯變化(P>0.05)，埋線組大鼠鼻黏膜中p-JNK的表達(dá)水平降低(P<0.01)。

圖2 各組大鼠鼻黏膜中p-JNK及JNK的蛋白條帶

表4 各組大鼠鼻黏膜中p-JNK、JNK表達(dá)水平比較

3 討論

穴位埋線屬于通過局部埋入羊腸線來對(duì)穴位產(chǎn)生物理及生化刺激，進(jìn)而通過經(jīng)絡(luò)將刺激傳入體內(nèi)，最終起到治療疾病的作用。AR屬于中醫(yī)理論“鼻鼽”范疇，其病機(jī)在于肺脾腎功能失調(diào)，針對(duì)病機(jī)選擇百會(huì)肺俞脾俞穴進(jìn)行針灸或埋線可以起到治療作用[9-10]。本研究在AR大鼠中選擇“百會(huì)”“肺俞”“脾俞”3個(gè)穴位進(jìn)行埋線治療。

AR的病理本質(zhì)是IgE介導(dǎo)的鼻黏膜炎癥反應(yīng)，已有多項(xiàng)AR相關(guān)的動(dòng)物研究采用鼻黏膜HE染色病理改變?cè)u(píng)價(jià)不同手段治療AR的療效，認(rèn)為通過HE染色觀察病理改變具有直觀性及客觀性均較強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)[11-12]。本實(shí)驗(yàn)觀察到，模型組大鼠的鼻黏膜出現(xiàn)了水腫充血、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等典型的AR病理改變；在穴位埋線及西藥治療后，AR的病理改變均明顯改善，因此筆者認(rèn)為穴位埋線用于AR治療能夠減輕鼻黏膜損傷，抑制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

本研究通過HE染色觀察鼻黏膜的病理改變后，還通過分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)參與AR病理改變的多種分子變化，以此進(jìn)一步確認(rèn)穴位埋線治療AR的價(jià)值。IgE介導(dǎo)炎癥反應(yīng)激活在AR發(fā)病中起重要作用，接觸過敏原后IgE的大量釋放能夠引起嗜酸性粒細(xì)胞向鼻黏膜遷移、浸潤(rùn)，進(jìn)而釋放炎癥介質(zhì)Eotaxin來介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，引起黏膜損傷。在HE染色中已經(jīng)觀察到，模型大鼠鼻黏膜中有嗜酸性粒細(xì)胞的大量浸潤(rùn)，進(jìn)一步觀察炎癥介質(zhì)IgE及Eotaxin的變化，發(fā)現(xiàn)模型組血清及鼻黏膜中IgE、Eotaxin的含量均增多，而西藥組和埋線組血清及鼻黏膜中IgE、Eotaxin的含量均減少，且2組間IgE、Eotaxin比較無差異。因此筆者認(rèn)為，穴位埋線用于治療AR能夠抑制炎癥反應(yīng)，且抑制作用與西藥相當(dāng)。

已有多項(xiàng)研究證實(shí)，Th1、Th2、Th17失衡與AR發(fā)病有關(guān)，相應(yīng)細(xì)胞因子在AR發(fā)病過程中也出現(xiàn)了改變[13-15]。在過敏原刺激IgE釋放的過程中，Th1產(chǎn)生的細(xì)胞因子IFN-γ介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答并抑制IgE的釋放，Th2產(chǎn)生的細(xì)胞因子IL-4、IL-5介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答并促進(jìn)IgE的釋放；同時(shí)，IgE還能招募Th17細(xì)胞不斷浸潤(rùn)并分泌IL-17，進(jìn)而起到趨化作用并加重鼻黏膜的病理改變[13-15]。本研究對(duì)AR模型大鼠上述細(xì)胞因子的分析與既往其他學(xué)者[13-15]的研究一致，即模型組血清及鼻黏膜中IFN-γ的含量降低，IL-4、IL-5、IL-17的含量增多；而在治療后，西藥組及埋線組的上述細(xì)胞因子均明顯改善。因此筆者認(rèn)為，穴位埋線用于治療AR能夠調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子的釋放，且調(diào)節(jié)作用與西藥相當(dāng)。

在穴位埋線用于非酒精性脂肪肝大鼠治療的實(shí)驗(yàn)中，穴位埋線被證實(shí)能夠通過抑制JNK通路的激活來改善胰島素抵抗及炎癥反應(yīng)[16]，提示JNK通路可能是穴位埋線發(fā)揮治療作用的靶點(diǎn)。JNK通路是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)與免疫應(yīng)答的重要信號(hào)通路，信號(hào)分子JNK發(fā)生磷酸化是信號(hào)通路激活的方式，表現(xiàn)為p-JNK表達(dá)增加。陳超蕾等研究證實(shí)，在脂多糖誘導(dǎo)的肺組織炎癥中，JNK通路的激活與多種ILs的異常分泌有關(guān)[17]；肖文艷等研究證實(shí)，在金葡菌刺激巨噬細(xì)胞活化的過程中，JNK通路的激活介導(dǎo)了IL-5的分泌[18]；Xiong Y等研究證實(shí)，在氣道過敏小鼠中，JNK通路的激活能刺激Eotaxin的釋放[19]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)JNK通路的分析結(jié)果與既往研究報(bào)道一致，即模型組鼻黏膜中p-JNK的表達(dá)增多；進(jìn)一步分析治療后JNK通路的變化可知，埋線組鼻黏膜中p-JNK的表達(dá)減少，而西藥組鼻黏膜中p-JNK的表達(dá)無明顯變化。結(jié)合既往其他學(xué)者報(bào)道JNK通路對(duì)IL-5、Eotaxin等的調(diào)控作用，筆者認(rèn)為穴位埋線治療抑制炎癥介質(zhì)釋放、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子釋放的作用與抑制JNK通路激活有關(guān)，但其具體的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究的加以驗(yàn)證。