中醫藥干預RA性骨病中Wnt/β-catenin信號通路的研究進展?

王 鋼， 周孟茹， 李平順， 馬鵬程

(1.甘肅中醫藥大學附屬醫院風濕骨病科，蘭州 730000；2.蘭州大學基礎醫學院，蘭州 730000；3.甘肅中醫藥大學，蘭州 730000)

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以進行性軟骨破壞和骨侵蝕為特征的慢性疾病[1]。骨破壞或骨量丟失是RA的嚴重并發癥，主要在于成骨細胞(osteoblast，OB)與破骨細胞(osteoclast，OC)關系失衡、OC的數量及功能亢進導致[2-3]。隨著分子生物學發展，Wnt/β-catenin信號通路在RA性骨病干預中的核心作用得到公認，其對OB分化、生長、凋亡及功能表達具有重要意義。目前體內外實驗和動物實驗均證明，中醫藥可通過上調Wnt蛋白、β-catenin等關鍵性因子激活Wnt/β-catenin信號通路，進一步活化骨形成關鍵核因子Rnux2，促進OB分化，達到干預骨病目的。現將中醫藥通過Wnt/β-catenin信號通路干預RA性骨病的機制研究及其最新進展作如下述評。

1 RA性骨病的實質

《中西匯通醫經精義》曰:“腎藏精，精生髓，髓養骨，故骨者，腎之合也。髓者，發精所生，精足則髓足，髓在骨中，髓足則骨強。[4]”腎之精氣盛衰，直接影響骨的功能與形態。痹證者臟腑功能失調、氣血陰陽失衡，直接或間接影響骨的生長代謝而致骨病。現代醫學中RA疾病特征是關節滑膜炎和血管翳的形成，可因免疫紊亂或遺傳等因素使成纖維細胞樣滑膜細胞(FLS)活化、增殖并產生細胞因子和炎癥趨化因子(如IL-1、IL-6、IL-17等)，導致OC異常激活和OB分化受抑，OC與OB關系失衡，骨侵蝕大于骨重塑，就會出現骨質破壞、骨質疏松等病理損傷[5]。因此，諸多學者通過RANKL-RANK-OPG信號通路、Wnt/β-catenin信號通路、Wnt/Ca+2信號通路、BMP信號通路等調控骨細胞分化進程對RA性骨病針對性防治，并取得理想效果，其中研究較多的是Wnt/β-catenin信號通路[6]。

2 Wnt/β-catenin信號通路的調控機理

圖1示，Wnt信號通路于1982年由Nusse等首次報道，其包括依賴β-catenin的經典通路與不依賴β-catenin的非經典通路。Wnt/β-catenin信號通路又稱Wnt經典信號通路，主要通過Wnt蛋白家族、β-catenin等[7]關鍵性因子激活Runx2等基因轉錄，參與胚胎發育期多種重要細胞生長進程的調控及器官的發育，尤其對OB的生長、分化與凋亡和骨形成具有重要意義。因此，β-catenin的磷酸化/穩定積累并精準入核是Wnt/β-catenin信號通路持續活化的基礎[8]。

圖1 Wnt/β-catenin信號通路圖像[13]

Wnt/β-catenin信號通路由Wnt蛋白家族、膜受體、胞質復合物、核內轉錄因子、信號通路抑制劑、下游調控因子等大分子復合物組成，實現了由胞外到核內的信號傳導，啟動骨細胞靶基因轉錄，促進成骨分化。當胞外的Wnt蛋白與膜受體(由低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP)5，6和卷曲蛋白(Fz)家族組成)結合，活化散亂蛋白(Dvl)通過與Axin的直接作用，誘導胞質復合物(APC、Axin、GSK-3β、β-catenin)降解，抑制GSK-3β活性，減少β-catenin的磷酸化并使其在胞內穩定積累且精準入核，與轉錄因子(TCF/LEF)結合，調節靶基因(Runx2、Cbfa1等)的表達[9]。當胞外缺乏Wnt蛋白，β-catenin與Axin、APC、GSK3等形成降解復合物，促進β-catenin磷酸化，被E3泛素連接酶降解[10]。另外Wnt/β-catenin信號通路中還存在一些重要的負向調節因子，如抑制因子Dickkopf 1(DKK1)、硬化蛋白(sclerostin，SOST)和分泌型Fz相關蛋白(sFRP)等[11]。DKK1主要與LRP5結合進而抑制和降解胞內的四聚體；SOST可與Wnt蛋白競爭性結合LRP5，從而抑制其通路激活；sFRP可與Wnt蛋白形成穩定復合物，阻止其與膜受體結合[12]。

3 與RA性骨病干預相關的OB

骨髓間充質干細胞具有多向分化的能力，在一定條件誘導下可分化為OB、軟骨細胞等。OB是骨重塑的主要功能細胞，負責骨基質的合成、分泌和礦化；堿性磷酸酶(ALP)與礦化結節可作為OB分化成熟的特征指標之一[14]。國內外研究發現，Wnt/β-catenin信號通路在骨髓間充質干細胞成骨分化過程中扮演著重要角色，而Wnt/β-catenin信號通路抑制結果主要在OC與OB、FLS中表現明顯，導致OB分化受抑和凋亡程序啟動，繼發OC異常活化，促進骨質侵蝕和骨質疏松的發生發展[15]。

淫羊藿、骨碎補是臨床治療RA性骨病最為常用的單味中藥。大量文獻報道，淫羊藿及其活性成分淫羊藿苷可從基因、細胞分子等多水平影響OB的增殖分化，提高ALP活性，抑制凋亡，增強生物學功能[16]。郭英等[17]發現，骨碎補總黃酮可通過調控Wnt/β-catenin信號通路促進大鼠BMSCs向OB分化。另有研究證明，中藥復方補腎活血顆粒含藥血清能顯著提高OB中ALP的活性，增加礦化結節數量[18]。壯骨止痛方(淫羊藿、補骨脂、狗脊、川牛膝等組成)[19]與清熱活血方[20]均可激活Wnt/β-catenin信號通路，促進OB分化與成熟，調節OB和OC平衡，發揮骨保護作用，以減輕CIA大鼠骨質破壞。

4 與RA性骨病干預相關的OC

OB及骨髓基質細胞表面可表達核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)和骨保護素(osteoprotegerin，OPG)。RANKL首先激活OC前體細胞(OCPs)表面的核因子κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)受體并與之結合，從而將信號傳給胞內，然后進一步級聯激活下游各種由蛋白激酶介導的信號傳導途徑以誘導OC的形成、分化，增強骨吸收。OPG和RANK競爭性地與RANKL結合，減少RANK與RANKL結合，抑制OC分化成熟，誘導OC凋亡[21]。

根據腎主骨生髓理論，在RA性骨病的臨床治療中應用了大量補腎中藥，部分研究[22]證實這一理論的正確性。補腎中藥對骨細胞有正向調節作用，促進OB分化，同時抑制OC活化、增殖并啟動凋亡程序，既可修復骨質又減輕骨質破壞。通過實驗發現，槲皮苷[23]、雷公藤甲素[24]、(5R)-5-羥基雷公藤內酯醇[25]均能抑制RANKL-RANK-OPG信號通路，降低RANKL/RANK/OPG比值，從而在RA治療中發揮抑制OC生成和骨破壞緩解關節炎癥作用。有研究表明，斷藤益母湯對RA的骨破壞具有抑制作用，其機制之一可能是通過影響Wnt信號通路相關蛋白及DDK1蛋白表達，激活Wnt/β-catenin信號通路，從而抑制OC的分化與增殖[26]。

5 與RA性骨病干預相關的Wnt蛋白家族

Wnt蛋白家族由19種分泌性糖蛋白組成，其結構富含半胱氨酸，與棕櫚酸酯形成難溶于水的共價化合物游離于胞外，在骨細胞分化與骨重建過程中發揮生物學作用。研究表明，Wntl、Wnt7b、Wnt10b等可影響OPG表達或OPGmRNA轉錄以促進成骨分化；而Wnt3a、Wnt4、Wnt5a和Wnt16等通過調控RANKL/OPG比率穩定骨細胞平衡關系[27]。Wnt/β-catenin信號通路Wnt蛋白配體主要包括wntl、wnt3、wnt3a、wnt7b、wnt8等[28]。Wntl可促進OB的分化和成熟并防止細胞的凋亡，主要機制是Wntl與膜受體結合，激活Wnt/β-catenin信號通路，增加β-catenin有效濃度，上調骨重塑相關基因Runx2及下游因子的表達水平，促進OB的分化、成熟；Wntl可抑制OB與骨細胞程序性凋亡，增加OB的數量與活性[29]。Wnt3通過激活Wnt/β-catenin信號通路，促進OB的增殖、分化和成熟，同時也能活化非經典Wnt/JNK信號通路，抑制OC的數量與功能[30]；Wnt3a刺激Wnt/β-catenin信號通路上調OB的OPG表達，競爭性地抑制RANKL與RANK結合，抑制OCPs的分化[31]。

目前對于中醫藥直接調節Wnt1、wnt8蛋白干預RA性骨病的研究較少，主要是集中于其下游因子β-catenin蛋白，而通過調節Wnt3、wnt3a、wnt7b 蛋白干預骨病的研究比較熱門。研究報道，維藥買朱尼[32]可減少炎性細胞趨化因子，抑制炎性細胞聚集與活化，同時上調Wnt3a、β-catenin的表達，抑制OC功能。鞠大宏等[33]認為，激素性OP主要因OB中Wnt3a等蛋白和其mRNA的表達下調導致，左歸丸能通過上調Wnt3a及其mRNA的表達防治骨病。秦夢等[34]研究發現，右歸丸也可上調Wnt3a、wnt7b 蛋白表達水平，促進OB的增殖、礦化及抑制OC活性，起到干預骨病作用。

6 與RA性骨病干預相關的膜受體

膜受體由低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6(LRP5/6)和卷曲蛋白(Fz)組成。LRP5/6屬于LRP家族成員，為單次跨膜蛋白，其中LRP5為輔助受體[35]。通過與Wnt-Fz復合物的脂質成分結合，啟動Wnt/β-catenin信號通路；Fz是細胞表面特異性跨膜蛋白，N端富含半胱氨酸能與Wnt蛋白特異性結合[36]，胞內與蓬亂蛋白作用，穩定胞質復合物，抑制β-catenin降解，與LRP5/6共同作用完成信號傳導。

劉梅潔[37]等在骨質疏松機制研究中表明，激素可降低OB中Wnt3a、LRP-6、β-atenin和其mRNA的表達，而滋補腎陰法的代表方左歸丸，可上調LRP-6等信號通路活化關鍵因子的表達以防治OP。許應星等[18]研究表明，補腎活血顆粒含藥血清能顯著增加OB中ALP、LRP5的表達，并促進礦化結節的形成。另外研究顯示，牛膝多肽[38]、補骨脂素[39]、龍須藤多肽[40]能上調Fz，從而激活Wnt/β-catenin信號通路。

7 與RA性骨病干預相關的胞質復合物

胞質復合物是由Axin、APC、GSK-3β、β-catenin組成的四聚體。Axin是中心分子，N端RSG區域、C端DIX區域分別與APC、散亂蛋白特異性結合，中間包裹β-catenin形成胞質復合物。當Wnt蛋白與膜受體結合后，通過與散亂蛋白作用，Axin被征募到細胞膜，與LRP5輔助受體結合抑制GSK-3β活性，β-catenin釋放入核完成信號傳導[41]。糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)是一種絲氨酸(S)/蘇氨酸(T)激酶，通過磷酸化β-catenin末端的3個絲氨酸/蘇氨酸(S33、S37、T41)，促進β-catenin被特定的泛素酶系統識別而被降解[42]。β-catenin是一類在Wnt/β-catenin信號通路中發揮樞紐作用的多功能蛋白，大量實驗證明，β-catenin是影響Runx2基因轉錄的關鍵因素，低濃度β-catenin可抑制間質細胞Runx2基因的表達，從而抑制間質細胞的成骨分化；若β-catenin基因缺失，導致RANKL/RANK/OPG失衡及相關受體功能改變，會影響OC的生成[43]。

GSK-3β、β-catenin蛋白活性與濃度是Wnt/β-catenin信號通路激活的關鍵因素。有研究報道，黃連小檗堿[44]對GSK-3β水平有明顯的調節作用；黃芩苷[45]、牛膝多肽[38]、補骨脂素[39]、龍須藤多肽[40]可上調β-catenin，促進GSK-3β磷酸化，保證β-catenin入核傳遞信號，激活Wnt/β-catenin信號通路，從而促進骨質修復。另外在中藥復方對OB增殖活性研究中發現，右歸丸[46]、壯骨止痛方[19]、斷藤益母湯[26]均可使β-catenin蛋白表達明顯增多，GSK-3β蛋白表達減少，說明以上方劑改善骨骼質量的作用機制可能是通過激活Wnt/β-catenin信號通路，促進OB分化與成熟從而防治骨病。

8 與RA性骨病干預相關的核內因子-Runx2/Cbfa1

Runx2是Runt結構域基因家族成員之一，是成骨分化特異性轉錄因子，通過調控成骨標志基因的轉錄，從而促進OB分化。目前發現，Runx2能調控成骨標志基因包括骨鈣素、I型膠原、骨涎蛋白和骨橋蛋白等；除此之外，Runx2能夠影響ALP的活性和OB的礦化等[47]。Runx2與Cbfa1分布在OB中，主要通過早期誘導OB的分化和后期抑制OB凋亡等機制，促進多功能間質干細胞向OB分化[48]。

中藥淫羊藿是一種骨破壞修復的常用藥，研究顯示[49]淫羊藿能夠上調骨髓基質干細胞Cbfa1的表達，促進OB分化增殖，為中藥干預骨病提供了組織細胞和分子生物學基礎證據。高璐等[50]研究發現，補腎中藥淫羊藿、補骨脂、女貞子、何首烏有效成分配伍能提高骨髓間充質干細胞增殖率，促進骨髓間充質干細胞分化為OB，其機制與上調Runx2、OSX的基因表達相關。胡流超等[51]通過慢病毒載體介導Runx2基因沉默，使大鼠骨質疏松骨折愈合延緩，補腎活血湯能上調Runx2/Osterix表達，逆轉Runx2基因沉默的效應，具有明顯促進骨折愈合的作用，對骨質疏松性骨折具有良好的治療效果。

9 與RA性骨病干預相關信號通路抑制劑-DKK1

DKK1是Wnt/β-catenin信號通路的一個負調控蛋白，通過鈍化LRP5/6，阻止Wnt3a-Frz-LRP復合物的形成，封閉Wnt/β-catenin信號通路[52]，阻斷早期OB形成并誘導未成熟的OB凋亡。研究發現，在RA患者被侵蝕的關節中，DKK1過度表達且促炎因子TNF-α明顯增多(TNF-α可進一步誘導DKK1活化)，通過抑制OB數量與功能阻止骨重建[53]。

研究報道，活血化瘀中藥可以通過下調DKK1及其骨重建基因，激活Wnt/β-catenin信號通路，從而影響OB的分化，促進骨折愈合[22]。吳海華[54]等在OA大鼠模型中發現，DKK1在OA組的表達顯著高于正常組，且DKK1含量與病程呈正比關系，消骨痛湯通過抑制DKK1的表達，緩解病情進展。

10 與RA性骨病干預相關的下游調控因子-BMP2

BMP2屬于轉化生長因子β超家族，對OB增殖分化與骨質修復過程有重要意義，可通過提高LRP5的表達促使與Wnt蛋白結合；或通過促進β-catenin基因表達和蛋白合成，抑制β-catenin磷酸化，激活Wnt/β-catenin信號通路，促使BMSC成骨分化[14]。

在骨碎補總黃酮對骨質疏松療效研究中發現，骨碎補總黃酮組大鼠股骨組織的骨小梁數量、密度、布局及完整性均優于其余各組，其機制可能是通過上調股骨組織中BMP-2蛋白和血清中的骨鈣素水平，促進大鼠BMSC向OB分化，進而促進骨的形成[55]。研究發現，淫羊藿素(ICT)有類雌激素(ER)活性作用，可促進OB株增殖、分化，主要因為ICT劑量依賴性地提高BMP-2的表達；而阻斷ER受體信號后，ICT促OB分化作用明顯下降[56]。另有報道，活血化瘀利水消腫方能提高骨組織中BMP-2的含量，促進OB的生成，增強骨組織強度、韌性[57]。

11 展望

“腎-髓-骨”一體論是RA性骨病的理論基礎，其變在骨，其本在腎，肝腎虧虛、氣血不足、骨骼失養終為骨病。從查閱整理文獻過程中就得出，無論是單味藥或者中藥復方，其性味、歸經都集中于肝腎，并與氣血陰陽有關，最終作用于骨。大量文獻表明，中醫藥通過激活Wnt/β-catenin信號通路干預RA性骨病的發生發展，具體機制是通過上調或者下調其過程中的蛋白、因子的轉錄，從而影響OB、OC的發育分化，促進骨基質的形成和礦化，抑制骨量丟失。隨著分子生物學發展，中醫藥通過調控Wnt/β-catenin信號通路干預RA性骨病機制方面有了一定發展，為中醫藥干預RA性骨病提供了大量潛在的作用靶點，同時也為各調控因子的單克隆抗體研發提供了實驗基礎。

盡管此類研究越來越多，但仍存在一些問題：(1)在藥理、藥效學方面的研究多局限于單味中藥，但中藥單味藥和復方藥作用條件與成分復雜，有效成分難以分離提取，當前的研究僅僅是部分機制，缺乏其代謝產物具體的作用靶點及作用機制，對準確作用劑量的量效把控研究不足，這也可能是以后的發展方向；(2)對于不同疾病，相同中醫藥可激活亦可抑制Wnt/β-catenin信號通路，如補腎活血中藥干預RA性骨病通過激活Wnt/β-catenin信號通路，促進OB成骨作用；干預骨性關節炎通過抑制Wnt/β-catenin信號通路發揮保護關節軟骨，緩解疼痛的效果；這有可能說明中醫藥對該通路可能有雙向調節作用，但其理論還有待進一步的研究；(3)文獻評價Wnt/β-catenin信號通路中核內轉錄因子較少，中醫藥可直接促進間質干細胞成骨分化，是否也通過調控Runx2表達，間接促進間質干細胞成骨分化；或者中醫藥可上調β-catenin蛋白，但不能充分證明β-catenin是否入核以激活Wnt/β-catenin信號通路，此類問題有待于進一步研究。