Plackett-Burman聯合效應面法優化超聲輔助乙醇提取枳雀總酚工藝

張震，石凱欣，潘思軼

華中農業大學食品科學技術學院/環境食品學教育部重點實驗室，武漢 430070

最新的大規模流行病學研究表明，藥用植物因其副作用小、治療靶點多，已成為治療心血管疾病、功能性和慢性胃腸道疾病、癌癥等復雜機制疾病的重要選擇[1]。枳雀(CitruswilsoniiTanaka)，又名香圓、宜昌檸檬等，屬蕓香科柑橘屬，其果皮較厚，種子大而多，味極酸苦而具有香氣[2]。枳雀始載于《神農本草經》，具有理氣寬中、行滯消脹的功效，為歷版《中國藥典》所收載，也是國家衛生健康委員會頒布的可用于保健食品的原料。眾所周知，酚類物質是柑橘果實中最豐富的代謝產物，柑橘酚類物質在抗炎、抗氧化、降血脂、抗腫瘤、調節免疫功能、改善胃腸道功能等方面功效顯著，且安全性高、無副作用[3]。

超聲輔助提取技術在溶劑消耗和能量輸入方面是一種環境友好的非熱技術，超聲波用于活性物質的提取受到廣泛關注[4-5]。吳梅青等[6]研究發現柑橘皮超聲提取液中的多酚抗氧化能力顯著高于微波提取法、回流提取法、水提法和堿溶酸沉法。同時，Khan等[7]報道了超聲優化后的柑橘皮總酚含量為275.8 mg/100 g，柚皮苷和橙皮苷的含量分別為70.3和205.2 mg/100 g，顯著高于傳統的提取方法。由此可見，超聲波輔助提取生物活性成分具有節能、省時、高效的優勢。

本研究采用Plackett-Burman聯合星點設計-效應面法(central composite design response surface design,CCD-RSM)評估和優化了影響超聲輔助乙醇提取枳雀總酚含量的工藝參數，旨在最大限度提高枳雀酚類物質的得率，并采用HPLC法對枳雀提取液的酚類物質進行定性定量分析，以期為枳雀活性物質的深加工及應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮枳雀(CitruswilsoniiTanaka)果實，購自陜西省城固縣果業局。將果實冷凍干燥至恒質量后過孔徑0.15 mm的標準篩，將得到的枳雀凍干粉在-20 ℃避光保存，備用。18種酚類物質的色譜級標準品(≥98%)購自上海源葉生物科技有限公司；色譜級甲醇和甲酸均購自美國Fisher公司；Folin & Ciocalteu酚試劑購自美國Sigma公司；其他分析級的化學藥品和試劑均購自上海國藥控股化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

QE-100g高速萬能粉碎機，浙江屹立工貿有限公司；KQ-300DE超聲波清洗器，江蘇昆山市超聲儀器有限公司； Waters e2695儀，美國Waters公司；UV-1800紫外分光光度計，日本島津科學儀器公司。

1.3 超聲波輔助乙醇法提取枳雀酚類物質

精確稱取1 g枳雀凍干粉置于錐形瓶中，用錫箔紙包裹避光并用橡膠塞密封，采用超聲波輔助乙醇提取，將獲得的混合物在4 ℃以8 000 r/min離心15 min，收集上清液，并在40 ℃濃縮以除去乙醇。最后，將枳雀提取物以80%甲醇和二甲亞砜(體積比1∶1)定容于25 mL棕色容量瓶中，待檢測。

1.4 枳雀總酚含量的測定

根據Cliffe等[8]的方法并適當修改測定枳雀提取物中的總酚含量。取1 mL稀釋待測液和5 mL 10%的 Folin & Ciocalteu酚試劑，混勻后避光靜置5 min，加入4 mL 75 g/L Na2CO3溶液，在40 ℃的水浴中反應10 min，最后在760 nm處進行吸光度的測定。以不同質量濃度梯度的沒食子酸對照品溶液制備標準曲線，得到沒食子酸標準曲線方程為y=9.9780x+0.0196，R2=0.999 3。樣品中的總酚含量以每克枳雀凍干粉樣品中所含沒食子酸當量表示，單位為mg/g，計算公式如下：

總酚含量=CVn/m

(1)

式(1)中，C為單位體積枳雀提取物的沒食子酸質量，mg/mL；V為所得枳雀提取物的總體積，mL；n為紫外分光法測定時樣品的稀釋倍數；m為枳雀凍干粉的總質量，g。

1.5 單因素試驗設計

采用本文“1.3”的處理方法，分別考察浸泡時間、液料比、乙醇體積分數、超聲時間、超聲溫度共5個因素對枳雀總酚含量的影響。固定液料比40 mL/g、乙醇體積分數80%、超聲時間20 min、超聲溫度30 ℃的提取條件，考察浸泡時間為0、5、10、15、20、25、30 min 對總酚含量的影響；固定浸泡時間15 min、乙醇體積分數80%、超聲時間20 min、超聲溫度30 ℃的提取條件，考察液料比為10、20、30、40、50、60 mL/g 對總酚含量的影響；固定浸泡時間15 min、液料比40 mL/g、超聲時間20 min、超聲溫度30 ℃的提取條件，考察乙醇體積分數20%、40%、60%、80%、100% 對總酚含量的影響；固定浸泡時間15 min、液料比40 mL/g、乙醇體積分數80%、超聲溫度30 ℃的提取條件，考察超聲時間為5、10、15、20、25、30 min 對總酚含量的影響；固定浸泡時間15 min、液料比40 mL/g、乙醇體積分數80%、超聲時間20 min的提取條件，考察超聲溫度為15、20、25、30、35、40 ℃對總酚含量的影響。根據單因素試驗結果初步確定各因素的較優范圍。

1.6 Plackett-Burman試驗設計

采用Plackett-Burman試驗對5個自變量進行關鍵因素的篩選，每個變量都以高和低2個級別表示，以枳雀提取物總酚含量為指標，選擇對枳雀總酚含量貢獻最大的3個因素做進一步分析。

1.7 星點設計-效應面試驗設計

根據Plackett-Burman試驗設計的結果，選擇乙醇體積分數、液料比、超聲溫度共3個因素，以枳雀提取物的總酚含量為響應值，使用包含3個因子和5個編碼級的CCD來擬合二階響應面，并設計6個重復的中心點用于估計純誤差。按照Design-Expert 10.0.7軟件設計CCD矩陣影響因子相應的編碼水平進行試驗。

1.8 枳雀提取物各酚類物質單體成分與含量的檢測

HPLC法參考張元梅等[9]的方法，并稍作修改。色譜分離在ZOR-BAX Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)中進行，流動相由0.1%的甲酸水溶液(溶劑A)和甲醇(溶劑B)組成，梯度洗脫程序如下：0～20 min，37%～50% B；20～35 min，50%～80% B；35～40 min，80%～100% B。綜合考慮可分4個波長進行檢測，即蘆丁的檢測波長為 260 nm，兒茶素、圣草次苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、圣草酚、肉桂酸和柚皮素的檢測波長為 283 nm，綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、甜橙黃酮、川陳皮素和桔皮素的檢測波長為 330 nm，楊梅素、槲皮素、山奈酚的檢測波長為 367 nm，紫外吸收光譜輔助定性。枳雀提取物和各標準溶液經0.22 μm的微孔有機濾膜過濾后進行HPLC檢測分析。

1.9 數據處理

每組試驗重復3次，結果以“平均值±標準偏差”表示。運用SPSS Statistics 23軟件對數據進行處理分析。

2 結果與分析

2.1 枳雀酚類物質提取工藝的單因素試驗

從圖1A可見，在0～30 min，枳雀多酚含量隨著浸泡時間的延長，呈現先升高后降低的變化趨勢。在浸泡15 min時進行超聲提取所得的總酚含量最高，為14.66±0.15 mg/g。隨著浸泡時間的延長，枳雀總酚含量迅速下降，浸泡25 min后的枳雀總酚含量僅為最高含量的70%左右。這可能是由于浸泡時間過短，枳雀凍干粉不能很好地分散，有些甚至聚集在溶劑中，因反應接觸面積的減少而影響了其總酚得率。另一方面，浸泡時間過長會使枳雀組織中的糖類、蛋白質等擴散出來，甚至形成膠團依附于粉末表面，阻礙了枳雀多酚的溶出，導致其含量降低。綜上，選取浸泡時間10～20 min用于篩選試驗。

從圖1B可見，隨著液料比由10 mL/g增加到30 mL/g，總酚含量明顯增加，在液料比40 mL/g時，總酚含量達到最大值14.15±0.35 mg/g，隨著溶劑比例的增加，枳雀總酚含量開始減少并逐步穩定。溶劑量的增加使得細胞內外多酚濃度差變大，并且平衡會向胞外溶液傾斜而使得溶液濃度增大。基于低成本和高效率的考慮，選取液料比30～50 mL/g進行篩選試驗。

從圖1C可見，隨著乙醇體積分數的增加，枳雀總酚含量呈現先增加后減少的趨勢。在乙醇體積分數為40%時，枳雀總酚含量達到最高，為15.66±0.51 mg/g。在100%乙醇提取時，枳雀總酚含量驟降至9.06±0.51 mg/g，顯著低于其他組。過高的乙醇體積分數會使枳雀中的醇溶性和脂溶性雜質競爭性溶出，導致提取的枳雀酚類物質的總含量降低。綜上，選擇乙醇體積分數30%～50%進行篩選試驗。

同一組數據中不同字母表示差異顯著(P<0.05)。Values followed by different letters in the same group showed statistically significant(P<0.05).

從圖1D可見，枳雀總酚含量隨著超聲時間的延長呈現先增加后趨于穩定的變化趨勢，在超聲時間為20 min時獲得最高含量為14.38±0.35 mg/g。從節約時間及能源的角度，選取超聲時間15～25 min進行篩選試驗。

在超聲提取過程中，對溫度的控制至關重要。從圖1E可見，枳雀總酚含量隨著超聲溫度的上升呈現逐漸增加的趨勢，并在35 ℃達到最大值(15.54±0.32 mg/g)，比15 ℃時的總酚含量增加了52.80%。因此，選取超聲溫度30～40 ℃進行篩選試驗。

2.2 Plackett-Burman試驗設計篩選影響枳雀總酚含量的主要因素

使用Plackett-Burman法進行初步的因素篩選試驗。以枳雀總酚含量為響應值，通過軟件Design-Expert 10設計了12次試驗。結果發現，枳雀凍干粉和30%乙醇按液料比50 mL/g浸泡20 min后，在30 ℃超聲處理25 min時，可觀察到最低的枳雀總酚含量，為11.42±0.08 mg/g；枳雀凍干粉和50%乙醇按液料比30 mL/g浸泡10 min后，以40 ℃超聲處理25 min，此時，可獲得最高的枳雀總酚含量，為16.08±0.44 mg/g。

貢獻百分比可用于衡量各因素對響應值的影響程度的大小。由表1可知，5個因素對枳雀總酚含量的影響程度由高到低為：B>C>E>D>A，乙醇體積分數(68.52%)>液料比(13.39%)>超聲溫度(8.59%)>超聲時間(4.15%)>浸泡時間(0.95%)，其中，浸泡時間和液料比對枳雀總酚得率的提高有顯著的負效應，而乙醇體積分數、超聲時間和超聲溫度具有顯著的正效應。

表1 Plackett-Burman設計中各種因素對總酚含量的影響 Table 1 Influence of various factors on total phenol content in Plackett-Burman design

表2 Plackett-Burman試驗的方差分析 Table 2 Analysis of variance table for the Plackett-Burman design experiment

綜上所述，固定最佳的浸泡時間為15 min和超聲時間為20 min(圖1)，選擇乙醇體積分數、液料比和超聲溫度進行進一步的考察，分析這3個因素及其相互作用對枳雀總酚含量的影響。

2.3 星點設計-效應面法確定枳雀酚類物質的最佳提取條件

根據Plackett-Burman試驗中獲得的結果，使用CCD法進一步優化了提取參數，發現枳雀總酚含量為11.89±0.36～16.35±0.26 mg/g，波動范圍較大。

如表3所示，通過方差分析對CCD-RSM模型進行了評估。模型的P值小于0.001意味著不同處理間差異極顯著，模型可信度高。同時，不顯著的失擬項(P>0.05)和較低的純誤差(0.13)意味著該模型是精確且適用的。3個一次項、3個二次項及交互項AC對枳雀總酚含量的影響顯著(P<0.05)，根據F值大小得出各項對響應值的影響程度由強到弱依次為：C2>A2>A>B2>B>AC>C>BC>AB。由響應面分析得出的多元回歸方程為：Y=-20.3584+0.4802A+0.5174B+0.7403C+0.0016AB+0.0049AC-0.0034BC-0.0084A2-0.0050B2-0.0105C2，其中，Y、A、B、C分別表示枳雀總酚含量、乙醇體積分數、液料比、超聲溫度。

表3 CCD-RSM模型的單因素方差分析表 Table 3 Analysis of variance for the central composite design response surface model

由圖2的等高線圖可知，乙醇體積分數和超聲溫度之間存在顯著的交互作用，其等高線圖呈現橢圓形或鞍形，該結果與方差分析結果(表3)一致(P<0.05)。同時，乙醇體積分數和液料比之間的交互作用以及液料比和超聲溫度之間的交互作用并不顯著(P>0.05)，其等高線圖形狀接近圓形。

由圖2的三維響應曲面圖可知，在選定的因素范圍內，枳雀總酚含量隨著單因素值的上升呈現先增加后減少趨勢。其中，反映乙醇體積分數和超聲溫度的交互作用的響應曲面坡度最陡，表明其交互作用能夠顯著影響枳雀總酚的含量。

圖2 乙醇體積分數、液料比和超聲溫度的交互作用對枳雀總酚含量的影響

通過 Plackett-Burman聯合CCD進行的優化試驗獲得的最佳條件是：浸泡時間15 min、乙醇體積分數44.254%、液料比45.529 mL/g、超聲溫度34.208 ℃、超聲時間20 min，此時的枳雀總酚含量為16.260 mg/g。根據實際情況，調整參數為：浸泡時間15 min、乙醇體積分數44%、液料比45.5 mL/g、超聲時間20 min、超聲溫度34 ℃、共進行了5次驗證試驗。結果發現，該條件下枳雀總酚含量的實際值為16.29±0.12 mg/g，接近于預測值。因此，通過Plackett-Burman設計與星點設計響應面方法相結合優化枳雀酚類物質的提取是可靠且實用的。

2.4 枳雀提取物酚類物質組成成分分析

由圖3和表4可知，從枳雀提取物中同時分離出18種酚類化合物，其中，二氫黃酮類物質在枳雀提取物中含量最為豐富，約占總酚含量的94.60%，主要包括圣草次苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、圣草酚和柚皮素6種。枳雀富含柚皮苷，含量約為12.00 mg/g，約占總酚含量的91.36%，是其苦味的主要來源之一，其次含量較多的是圣草酚(176.91 μg/g)。此外，從枳雀提取物中檢測到少量酚酸類物質，包括綠原酸、咖啡酸、阿魏酸和肉桂酸。還檢測出少量多甲氧基黃酮類物質，如：甜橙黃酮、川陳皮素和桔皮素，含量分別為30.46、21.74和10.86 μg/g。

表4 枳雀提取物中酚類化合物的含量 Table 4 The concentrations of phenolic compounds in Citrus wilsonii Tanaka extract

數字代表的物質同表4。The substances represented by the numbers are the same as those in Table 4.

3 討 論

3.1 枳雀多酚的超聲提取工藝

據報道，超聲可以通過影響溶劑的物理性質、酚類物質的溶解度及某些酶的活性來增加超聲的處理效果[10-11]。Ma等[11]發現超聲輔助果膠酶提取柑橘渣水提物中的橙皮苷和酚酸時，底物結合和產物釋放過程加速，且果膠酶與果膠底物之間的親和力增強，這可能是由于在超聲場下暴露了果膠酶結構中更多的活性位點所致，從而使提取率增加。Plackett-Burman試驗的結果表明乙醇體積分數是影響枳雀總酚提取率最主要的因素。柳萌等[12]認為乙醇與水的混合液可以破壞酚類物質與蛋白質、多糖等物質的結合鍵，有利于酚酸的提取。由響應面圖結果可知，溶劑極性和溫度顯著影響酚類物質的降解效果。多酚得率隨著超聲溫度的上升而增加，可能得益于超聲波在液體介質中的傳播會產生強烈的混合效果，有助于提高質量傳遞，從而大大提高了溶質的傳遞速率[13]。然而，當溫度過高時，一方面會導致溶劑的黏度和表面張力均降低，蒸氣壓升高，使得空化作用的氣泡破裂程度降低，超聲處理的效果減弱；另一方面，酚類物質屬于易熱降解的活性成分，高溫會破壞多酚的結構，導致其產率降低[14]。在本研究中，響應面圖中多酚含量隨溫度的升高呈現先增加后降低的趨勢，這與上述研究報道的結果相一致[12-14]。

此外，在超聲提取過程中，單個酚酸含量的下降程度與其芳香環取代基的類別和數目有關，羥基數目越多、甲氧基數目越少，酚酸越容易被降解，因此，枳雀多酚提取物中的多甲氧基黃酮被較好地保留[15]。除此之外，糖基的存在可有效抑制酚類物質的降解。Biesaga等[16]發現經超聲提取后，蜂蜜中的9種酚酸和4種黃酮糖苷都很穩定，而7種苷元的回收率僅10%，黃酮醇苷元幾乎完全降解。因此，實際生產中應根據目標產物的結構特性來選擇適當的提取參數。

3.2 枳雀的組成成分分析

柑橘類水果中含有豐富的酚類物質，本研究通過HPLC對枳雀超聲提取物進行分析，共檢測出18種酚類物質，其中，柚皮苷的含量最高，其次是圣草酚。枳雀常作為枳殼、香櫞等中藥材的原料，用于破氣消積，化痰散痞，疏肝理氣等。陜南枳雀提取物中含有大量的柚皮苷，但卻僅含有微量的新橙皮苷，其質量不滿足我國藥典規定的香櫞原材料的要求，但是滿足作為枳殼原材料的規定，該結果與楊輝等[17]的研究結果一致。因此，枳雀作為枳殼與香櫞原料入藥的安全性和藥理作用等方面還有待進一步研究。

枳雀提取物中含有約90%以上的二氫黃酮類物質。二氫黃酮類化合物是藥用植物中廣泛存在的一類黃酮類化合物，具有抗癌、抗氧化、清除自由基、保護神經、治療心血管疾病及調理腸胃功能、抗炎、抗菌等多種藥理活性。因此，二氫黃酮類物質可能是枳雀在各類疾病治療中發揮作用的關鍵活性物質。作為一種母本為柚類、父本為枳類的雜交柑橘品種，枳雀中檢測出豐富的多甲氧基黃酮。研究發現，甜橙黃酮和川陳皮素等多甲氧基黃酮部分通過影響磷酸二酯酶的活性起到抑制TNF-α的作用，具有很好的抗炎作用[3]。此外，任雪等[18]提出廣陳皮的多甲氧基黃酮提取物可通過減弱或消除氧自由基及炎癥介質的過度釋放，對小鼠肺組織起到保護作用。因此，我們推測枳雀具有潛在的抗炎活性，可用于慢性炎癥疾病的治療方案中。

目前，國內外對枳雀活性成分的提取分離以及體外活性研究較多，而枳雀調節胃腸道健康、治療心血管疾病、調節免疫功能的機制并不明確，未來需要進一步探索枳雀對人體健康的干預機制，以期為臨床應用提供理論依據。