分析前因素對血液乙肝表面抗原檢測的影響*

孫俊艷，何成濤，劉海波，陳躍

(1.淮安市中心血站檢驗科，江蘇淮安 223001；2.南京紅十字血液中心研究室，南京 210003)

乙肝表面抗原(HBsAg)是篩查乙型肝炎最重要的血清學指標，標本質量保證是檢測結果準確性的重要分析前因素[1]，國內有學者對實驗室分析中儀器產生影響因素、明顯溶血標本或送檢時間進行研究，指出標本溶血和室溫保存4 h以上可影響檢測結果準確性[2-3]。但往往標本被非規范處理后，標本溶血、抗凝不充分等現象表現不明顯，使工作人員無法直觀判斷出標本是否合格，且無法對檢測結果正確賦值。本研究擬通過設計5種模式，驗證從標本采集到檢測前各種因素對檢測結果的影響情況，旨在指導標本的處理流程，最大限度的保證標本質量，消除標本對檢測結果的影響。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 STAR 8CH全自動酶免前處理系統、FAME24/20全自動酶免后處理系統(煙臺奧斯邦生物研發公司)，DL-5M低速冷凍離心機、KH20自動開蓋離心機(湖南湘儀實驗室儀器公司)，EDTA-K2抗凝管(江蘇康健醫療用品公司)，分離膠促凝管(江蘇康健醫療用品公司)。HBV酶聯免疫檢測試劑盒(北京萬泰股份公司)，酶聯四項質控標準血清(北京康徹思坦生物技術公司)。

1.2方法

1.2.1研究對象 收集2019年4月至11月于淮安市中心血站自愿無償獻血的300例獻血者的血液標本。女性78例，男性222例，年齡(40±2)歲。納入標準：獻血前征詢、初篩、體檢均符合《獻血者健康檢查要求》2011版要求，均由熟練工作人員進行采集，獻血者知曉本研究，自愿參與。排除標準：獻血前征詢、初篩、體檢不符合《獻血者健康檢查要求》2011版要求，不能參加獻血者；標本采集量不足或標本遭到污染時；標本不能按計劃時間進行檢測的；獻血者依從性差，無法完成本研究者。

1.2.2常規標本處理步驟 要求同一工作人員采用EDTA-K2抗凝管采集每位獻血者2管血液，每管樣本量為4～5 mL，標本無脂肪、無溶血現象，采集后臨時儲存環境為2～8 ℃。離心溫度為室溫(18～27 ℃)條件下進行分離，離心半徑21 cm，3 000 r/min離心10 min，2管同時分別進行20次檢測。

1.2.3分組模式 分別采取不同離心溫度、采集到離心不同時間間隔、不同離心和儲存順序、不同標本管類型、不同儲存溫度5種不同模式進行處理，每種方法采樣60人。5種模式中保證標本只有設計的影響因素不同，其他操作處理方法與常規操作步驟完全相同。

1.2.3.1不同離心溫度(以CT表示) 2支標本離心時分別采取室溫(18～27 ℃)和4 ℃離心，4 ℃離心使用低速冷凍離心機，離心半徑21.5 cm，3 000 r/min離心10 min，分別編為A、B組。

1.2.3.2采集到離心不同時間間隔 (以Ct表示) 從采集到標本進行離心處理的時間間隔為0 h和8 h的2支標本管分別編為C、D組。

1.2.3.3不同離心和儲存順序 (以Tm表示) 將標本管標本離心后儲存和儲存后離心2種情況的2支標本管分別編為E、F組，E組標本采集后立即離心后儲存于2～8 ℃ 4 h，F組標本采集后立即儲存于2～8 ℃，4 h后進行離心。

1.2.3.4不同標本管類型 (以At表示) 分別采用抗凝和促凝管采集的2支標本管分別編為G、H組。

1.2.3.5不同儲存溫度 (以ST表示) 標本采集后分別進行室溫(18～27 ℃)和立即置于2～8 ℃儲存的2支標本管分別編為I、J組，2種均在對應溫度下儲存2 h以上，再進行離心處理。

1.2.4計算公式 配對設計的標準偏差計算公式為：

注：n為樣本例數,d為同一樣本兩組測量結果之差，dm為同一樣本兩組數據差值平均值。

1.3統計學分析 采用SPSS 25.0統計軟件進行配對t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義，利用EXCEL 2007電子表格進行數據處理及復合標準差的計算。

2 結果

2.15種不同的因素對結果的影響 由表1可見，標本采集后處理時離心溫度、標本采集到離心時間間隔、儲存溫度3種模式中兩組處理方式之間的平均值之差分別為0.004 0、0.003 1、0.002 2，經統計，對HBsAg檢測結果的影響差異均有統計學意義(P<0.05)。離心與儲存順序、標本管類型2種模式中兩組處理方式之間的平均值之差分別為0.000 3、0.000 2、經統計，對HBsAg檢測結果影響差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 5種因素對HBsAg檢測結果影響

2.25種不同的因素的影響程度 據1.2.4中公式計算離心溫度、標本采集到離心間隔、離心和儲存順序、標本管類型、儲存溫度5種因素復合標準差，結果分別為0.005 5、0.004 5、0.002 6、0.002 0、0.004 9。影響程度由大到小依次為離心溫度、儲存溫度、標本采集到離心間隔、離心和儲存順序、標本管類型。

3 討論

影響實驗室檢測結果準確性因素主要有人員、儀器、試劑、實驗方法、標本質量等方面。自動化測量儀器的推廣和性能方面的持續改進、儀器的定期校驗及對室內質控的重視度增強均可有效控制分析中的各種影響因素。由于分析前的環節涉及較多，很多學者[4-5]認為可以通過強化分析前的規范化加以控制，但工作人員責任心及操作的熟練度差異，使標本的處理流程難以達到預期要求，這給分析前標本質量控制帶來很大難度，而實驗室標本接收普遍通過肉眼觀察判斷標本合格性，這為檢測結果準確性帶來一定的負面影響。

本研究顯示，標本采集后處理時離心溫度、標本采集到離心時間間隔、儲存溫度3種模式對HBsAg檢測結果具有很大影響。筆者分析原因認為，常溫離心時隨著離心時間加長，轉速增高，在離心機沒有溫度控制功能時，離心溫度會逐漸增高，細胞會發生破壞。如果全血標本常溫儲存較長時間，特別是環境溫度較高時，細胞同樣發生破壞，產生肉眼不可見的隱形溶血，釋放多種內源性干擾物質，干擾檢測結果。這與楊瑞鋒等[6]研究觀點相一致。另一方面全血標本在不分離狀態下儲存8 h時，隨著細胞的死亡，釋放一些生物活性物質或殘留細胞成分的干擾，均導致檢測結果假陽性產生，這與趙鴻翔等[7]和譙興強等[8]的觀點相一致。

離心與儲存順序和標本管類型模式對HBsAg檢測結果的影響無統計學意義，考慮到血漿與血清的主要區別是血清不含纖維蛋白原，血漿標本留取時抗凝充分，纖維蛋白原沒有析出，未對檢測結果造成明顯影響。因此，在日常工作中可以替代使用。而離心與儲存順序設計時儲存溫度在2～8 ℃環境中4 h，低溫環境中標本比較穩定，在小于4 h的情況下溶血現象不明顯，未對檢測結果造成明顯影響。

綜上所述，確保HBsAg檢測結果的準確性，不僅實驗室需要對分析中的各種因素加以控制，還要規范分析前全血標本的處理流程。雖然一些規范對標本采集后處理有一定要求，但由于環節較多、經手人員復雜等原因，對于規范的執行落實情況不到位，從而對標本質量產生不可預估的影響。本研究用數據驗證了標本處理環節中關鍵控制點，結果提示：為保證檢測結果準確性，全血標本采集后應立即使用低溫離心機進行分離，否則應立即放入2～8 ℃環境中保存，4 h內持續保持該溫度并使用低溫離心機分離，如果標本發生明顯溶血，應重新留取標本。