高分辨熔解曲線技術在篩查21羥化酶缺乏癥患者熱點基因突變中的臨床應用價值*

張新杰，徐曉薇，王朝，王學韜，呂玲，蔡春泉，舒劍波

(天津市兒童醫院&天津大學兒童醫院a.兒科研究所，b. 內分泌科，天津 300134)

先天性腎上腺皮質增生癥(congenital adrenal hyperplasia ,CAH)是一種常染色體隱性遺傳病，其中最為常見的是由CYP21A2基因缺陷引起的21 羥化酶缺乏癥(21-hydroxylase deficiency,21-OHD)，占比高達90%～95%。在2019年上海浦東召開的臨床遺傳學高峰論壇上，各專家均呼吁重視罕見病基因攜帶者的篩查。早期的篩查可降低新生兒死亡率、減少因女嬰外生殖器男性化而造成的性別誤判，同時改善其生長發育。因此，針對人群中21-OHD患者及攜帶者的CYP21A2致病基因熱點突變篩查具有重要意義。

21-OHD患者可根據其臨床表型分為失鹽型、單純男性化型、非經典型3種。在失鹽型中最常見的基因突變位點為CYP21A2基因I2G和 p.Q319X位點，在單純型中最常見的位點為I2G和p.I173N位點[1-5]。本研究建立的高分辨熔解曲線(high resolution melting curve, HRM)主要針對c.293-13A/C>G(I2G)、c.518T>A(p.I173N)、c.955C>T(p.Q319X)以及c.1069C>T(p.R357W)突變進行篩查。該技術具有高靈敏度，可檢測出基因中單個堿基的差異，并能初步識別DNA片段中的序列變體，目前已被成功應用于多種遺傳病的基因突變檢測，包括地中海貧血、Rett綜合征、Klinefelter綜合征[6-8]等。然而，其應用于檢測CYP21A2基因突變的相關報道少見[9]。本研究采用HRM技術篩查21-OHD患者CYP21A2基因突變，報道如下。

1 材料與方法

1.1研究對象 收集2009年1月至2014年12月于天津市兒童醫院內分泌科門診就診或內分泌病房住院且未經過臨床治療的21-OHD患者15例，其中男7例，女8例，年齡(2.6±2.7)歲。各患者21-OHD特異性實驗室檢查指標——血漿17-羥孕酮(17-OHP)的濃度為(143.3±96.5)ng/mL。同時排除非21-OHD引起17-OHP升高的11-羥化酶缺陷癥、P450氧化還原酶缺陷癥、17-羥基脫氫酶缺陷癥及17,20-裂解酶缺陷癥等。另收集同期保健門診就診的體檢健康兒童30例作為健康人對照組，其中男21例，女9例，年齡(6.4±2.2)歲。本研究經天津市兒童醫院醫學倫理學委員會審核批準(No.2016021)，各研究對象及家屬均知情同意。

1.2主要儀器及試劑 LightCycler?480高通量實時熒光定量PCR系統(美國Roche公司)，凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)，NanoDrop2000超微量紫外分光光度計(美國Thermo公司)。Forget-Me-NotTMEvaGreen qPCR Master Mix(美國Biotum公司)，血液基因組DNA提取試劑盒(Genomic blood DNA mini kit，北京康為世紀公司)，TaKaRa LA Taq酶(北京寶生物公司)。

1.3方法

1.3.1標本采集及基因組DNA的提取 采集21-OHD患兒就診時或住院時(體檢健康者于體檢時采集)的空腹靜脈血0.5 mL，EDTA-K2抗凝，采用血液基因組DNA提取試劑盒提取全血基因組DNA，NanoDrop2000超微量紫外分光光度計測定DNA的濃度和純度，取DNA吸光度(A260/280 nm)值在1.8～2.0之間，濃度為15～65 ng/μL的樣本用于后續試驗。DNA樣本置于-20 ℃保存。

1.3.2引物設計及普通PCR擴增CYP21A2基因 參考文獻[10]中的引物序列及PCR反應條件進行PCR反應。ME008上游引物序列:5′-GCTTCTTGA

TGGGTGATCAAT-3′，退火溫度56.5 ℃；ME066下游引物序列:5′-CTCAATCCTCTGCAGCG-3′，退火溫度61.1 ℃，產物片段大小 3 400 bp。 PCR總反應體系為25 μL，包括20 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs Mixture 2 μL, 2×La PCR bufferⅠ 12.5 μL，125 U LA Taq酶 0.25 μL，模板DNA 1.5 μL，無菌ddH2O補足體積至25 μL。反應條件:95 ℃預變性5 min；95 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s(每個循環溫度降低1 ℃)，72 ℃ 2 min，10個循環；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35個循環，整個PCR反應共計45個循環；72 ℃ 10 min。取擴增產物2 μL,經20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像儀掃描并拍照。

1.3.3DNA測序及序列分析 將部分擴增所得的PCR產物送至蘇州金唯智生物科技公司進行Sanger測序。測序結果用Chromas2 .6.4序列分析軟件分析并與GenBank中NCBI參考序列(NC_000006.12，NM_000500.7)進行比對分析。

1.3.4HRM引物設計與合成 應用Primer Premier 5.0軟件對CYP21A2基因各突變位點所在區域進行HRM引物設計。本次研究共設計了3對用于HRM檢測的引物，其中c.955和c.1069共用同一對引物。所有的HRM引物均委托蘇州金唯智公司合成，并采用tPAGE方式純化，見表1。

表1 HRM技術的特異性引物

1.3.5HRM檢測所用反應條件及結果分析 PCR 反應總體積為20 μL，包括 10 μL 預混液(2×PCR Mix)、10 μmol/L正、反向引物各1 μL，1 ngCYP21A2基因DNA模板。PCR反應條件:95 ℃預變性5 min，95 ℃ 變性30 s，60 ℃ 退火10 s，72 ℃延伸10 s, 共45個循環。HRM熔解曲線分析條件：95 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min，數據收集從65 ℃～95 ℃，溫度上升為1 ℃/s，且每升高1 ℃ 進行25次數據采集，將所獲取的數據使用 LightCycler?480高通量實時熒光定量PCR系統進行熔解曲線和差異圖分析。為排除單次實驗的隨機誤差，將所有經過測序的突變型樣本進行3次重復檢測，計算CYP21A2基因4個突變位點相應突變型的熔解Tm值的變異系數(coefficient of variation,CV)。

1.3.6統計學分析 數據分析采用SPSS 26.0統計軟件。

2 結果

2.121-OHD患者CYP21A2基因突變結果分析 對15例21-OHD患者的CYP21A2基因進行測序，并對其突變位點進行統計分析，結果見表2。在15例患兒中有9例為單一位點的純合突變，另外6例均攜帶2個不同位點的雜合突變。

表2 CYP21A2基因4個突變位點相關統計結果

2.2CYP21A2基因在c.293-13位點的PCR-HRM分析結果 針對CYP21A2基因上的c.293-13位點所建立的HRM分析方法能較好地區分致病位點的基因型，該位點是1個多態性位點，AA和CC均為野生基因型，用30例已經完成基因測序的健康人樣本進行方法驗證，沒有發現突變型，其典型的基因測序圖和差異熔解曲線見圖1。

注：A,c.293-13野生CC基因型;B,c.293-13野生型AA基因型;C, c.293-13純合突變基因型; D, c.293-13雜合突變A>G基因型;E, c.293-13雜合突變C>G基因型;F, c.293-13位點的差異熔解曲線；箭頭示突變位點。

2.3CYP21A2基因在c.518位點的PCR-HRM分析結果 應用上述方法對CYP21A2基因上c.518位點進行HRM分型檢測，其典型的基因測序圖和差異熔解曲線結果見圖2。

注：A,c.518野生TT基因型;B, c.518純合突變基因型;C, c.518雜合突變T>A基因型; D, c.518位點的差異熔解曲線；箭頭示突變位點。

2.4CYP21A2基因在c.955和c.1069位點的PCR-HRM分析結果 將CYP21A2基因中c.955C>T和 c.1069C>T這2個位點置于同一片段中，應用上述方法進行HRM檢測，其典型的基因測序圖和差異熔解曲線結果見圖3。

3 討論

為了保證HRM能準確地檢測21-OHD的致病基因CYP21A2，本研究應用PCR技術進行了初步擴增。Tusié-Luna等[11]和Prado等[12]報道在距離CYP21A2基因30 000 bp的位置上存在1個與之高度同源的假基因CYP21A1P，且這2個基因在外顯子區和內含子區的同源性分別高達98%和96%。故而，在本研究中應用PCR技術初步擴增CYP21A2基因特異性地排除假基因的干擾顯得尤為重要。本研究進一步將c.955C>T和c.1069C>T這2個相近位點設計在同一段PCR片段上進行擴增，突變位點在PCR產物中的位置并沒有影響HRM技術掃描分析的準確性，真正起影響作用的是PCR擴增產物的長度，這與Reed等[13]的報道相似。本研究建立的CYP21A2基因HRM分析方法能很好地區分突變型與野生型的標本，Tm值CV均較低，為后續臨床分析提供了一定的技術支持。

HRM是一種快速、可行、廉價且易于使用的方法。根據筆者經驗，相對于Sanger測序14元/樣品的成本，HRM檢測可以將每個患者的成本降低至3元/樣品，且其結果可以在半個工作日內獲得，而Sanger測序需要1～2個工作日。此外，如Jones等[14]報道的低水平的等位基因嵌合如果只通過基因測序手段極容易被漏檢，而HRM的檢測原理是基于核酸分子的基本特性，故能很好地避免這個問題。因此，將HRM用于大規模基因突變篩查及基因分型對于擁有大量患者的實驗室極具吸引力。

注：A,c.1069野生CC基因型;B, c.1069雜合突變C>T基因型;C, c.1069純合突變基因型; D, c.955野生CC基因型；E, c.955雜合突變C>T基因型；F, c.1069和c.955位點的差異熔解曲線;箭頭示突變位點。

HRM在21-OHD臨床檢測中也具有廣泛的應用策略。據21-OHD臨床實踐指南總結[15]，典型21-OHD的發病率依國家和地區的不同約為1∶14 000～1∶18 000。因此，在人群中大規模快速篩查高頻致病突變，輔助完善21-OHD的基因突變譜研究十分必要。此外，在臨床特殊群體如多囊性卵巢綜合癥(PCOS)患者中，利用本研究中的HRM檢測方法也具有重要的應用價值。Livadas 等[16]曾報道PCOS與非經典型CAH具有相似的臨床特征，如高雄激素血癥、多毛癥、排卵和月經功能障礙等。僅憑臨床表現區分該2種疾病是有一定難度的，對具有這類癥狀的患者，鑒別診斷PCOS和非經典型先天性腎上腺皮質增生(CAH)是正確治療的關鍵。Moran等[17]曾報道在育齡女性和患有高雄激素血癥的女性群體中，PCOS患病率較非經典型CAH升高40～50倍；Legro等[18]也建議，應該在高風險人群中，包括具有PCOS相應癥狀的女性中篩查非經典型CAH。所以，在基數略大的PCOS患者中利用本研究所建立的HRM檢測方法進行21-OHD基因篩查具有良好的應用前景。本研究建立的針對CYP21A2基因致病突變HRM的檢測方法適合在高危人群或臨床可疑患者中進行篩查，為后期對于21-OHD的流行病學調查提供了一種有效和便利的手段，具有較高的臨床應用價值。

本研究的局限性及不足之處在于目前HRM主要應用于致病基因已知的單基因遺傳病的突變篩查，報告受測基因序列中多存在1個或多個變異，因而不能完全取代基因測序。特別是針對CYP21A2基因上致病的嵌合重組以及大片段缺失，仍需要結合多重連接依賴探針擴增技術(MLPA)進行檢測。但它確實可將測序工作縮減為在HRM檢測陽性后的確證和對精確突變或多態性的最終診斷。此外，本研究中建立的HRM檢測方法未包含全部CAH的常見致病變異位點，這也是我們后續進一步研究的方向。