生防細菌PP19和SI17菌懸液對荔枝霜疫病的防病作用初探

鄭 麗，張海鵬，喻國輝，黃石連

（1.仲愷農業工程學院植物健康創新研究院/仲愷農業工程學院農業與生物學院/廣東省普通高校果蔬病蟲害綠色防控重點實驗室，廣東 廣州 510225；2.廣東省農業科學院果樹研究所/農業農村部南亞熱帶果樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室/廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點實驗室，廣東 廣州 510640；3.黃埔海關技術中心，廣東 廣州 510627）

【研究意義】荔枝作為中國南方特有的水果，其年總產值達62.88 億元［1］，荔枝霜疫霉（Peronophythora litchiiChen ex Ko et al.）是荔枝產區普遍發生且為害嚴重的重要病害，侵染果實后，造成裂果和爛果，長出白色霉狀物，嚴重影響外觀和品質，進一步加速果實褐變，影響鮮果貯藏和銷售［2-3］。目前，化學藥劑是重要防控措施，存在安全隱患和抗藥性風險。尋求高效、安全、無殘留、環境友好的生物制劑，切實保證水果產量和品質的需求迫切。生防制劑一般低毒，環境兼容性較好，符合當前綠色生產要求，該方法將成為水果采后病害防控和延緩褐變的重要措施之一。本研究前期優選到生防解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）PP19 和生防乙酰微小桿菌（Exiguobacterium acetylicum）SI17，擬探究兩株菌防控荔枝霜疫病的可能機理，為開發新型綠色農藥提供理論基礎。

【前人研究進展】研究表明，荔枝霜疫霉菌對羧酸酰胺類殺菌劑的抗性風險水平較低［4］。隨殺菌劑的使用推廣及用藥次數增多，病菌產生抗藥性的潛在性風險提高［5］。生物防治由于具備綠色、安全及有效等特點已成為蔬果采后病害防治的研究熱點［6-7］。生防菌劑對環境生態友好、安全性高且防治譜寬，在許多蔬果采后病害生物防治中有廣泛引用，如柑橘［8］、葡萄［9］、蘋果［10］、草莓［11］及梨［12］等。生防菌在荔枝生產和抗病性上的應用也有相關報道，其中以芽孢桿菌屬（Bacillussp.）為主［13-16］。果蔬采后病害的生防機理主要有水解酶［17］、營養和空間競爭［18］、重寄生［19］、分泌次生代謝物［20］以及誘導寄主抗性［21］。誘導抗性指的受到外界的刺激因子通過信號傳遞激活植物體內的應答信號從而產生廣譜持久抗性［22］。據報道，蠟質芽孢桿菌（Bacillus cereus）和枯草芽孢桿菌（B.subtilis）對桃軟腐病具有priming 效應［23-24］，能誘導抗病有關的酶如苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）的合成及合成降解病菌細胞壁的降解酶如幾丁質酶（CHI）和β-1,3-葡聚糖酶（GLU）［25］；惡臭假單胞菌Pseudomonas putida處理過的木瓜明顯提升抗性酶PAL、過氧化氫酶（CAT）、POD 及總酚含量從而抵抗木瓜炭疽病的發生［26］；接種紅灰鏈霉菌Streptomyces rubrogriseus可提高番茄根部POD 和超氧化物歧化酶（SOD）的活性從而提高抗病性［27］；哈茨木霉Trichoderma harzianum誘導過的茄子葉片內的抗病性相關酶SOD、POD、PPO 的活性升高抵御黃萎病［28］；生防菌梅奇酵母Metschnikowia zizyphicola處理梨果實，提升貯藏期間PAL 等抗性基因表達而提高抗病性。

【本研究切入點】從前期研究基礎出發，分析兩株分離自荔枝果皮的生防菌PP19 和SI17 的菌體懸浮液對采后荔枝霜疫病的防效，以及其對果皮抗病相關酶的影響，初步解析生防菌可能的作用方式。【擬解決的關鍵問題】明晰生防菌菌體懸浮液的作用效果，以及植物抗病性酶和相關活性物質的變化；揭示生防菌作用下植物抗病相關生理機制，旨在尋找新型高效的生防菌來防治荔枝果實采后霜疫病，減少荔枝采后運輸過程中的經濟損失。

1 材料與方法

1.1 菌株培養和植物材料

病原菌活化：由華南農業大學植物病理學系真菌實驗室提供，荔枝霜疫霉菌株為該實驗室2013 年從四川瀘州某荔枝果園果實上分離獲得，命名為SC18。將保存于16 ℃的病原菌在CJA（Carrot juice agar，200 g 去皮胡蘿卜，榨汁，瓊脂15 g，定容至1 L）上活化，25 ℃培養5～7 d，用適量無菌水洗下并經茶漏過濾，濾液收集于燒杯中。反復清洗多次，盡量將孢子囊從菌絲頂端洗脫下來，濾液即為游動孢子囊懸浮液。顯微鏡觀察其個數，調整到5×104個孢子囊/mL，備用。

生防菌活化：從-80 ℃冰箱中取出本實驗用生防菌PP19 和SI17，在LB（胰蛋白胨10 g、氯化鈉10 g、酵母提取物5 g、瓊脂糖15 g）平板上劃線，28 ℃下培養24 h，轉接到LB 培養液試管中，28 ℃、200 r/min 培養20 h 作為種子培養液，以1∶500的比例將種子菌液接到LB 培養液中培養24 h，4 ℃、6 000 r/min 離心15 min，去除上清液，0.85% NaCl 進行等體積重懸浮；隨后用滴液法檢測濃度，調整至濃度為5×108CFU/mL，備用。

果實采摘：來自海南儋州南陽農場某果農的妃子笑荔枝，約80%成熟度采摘到實驗室。在室溫條件下，擺放到保鮮盒（盒底鋪上滅菌濾紙，直徑18 cm，滅菌水潤濕，保鮮盒規格為 323 mm×220 mm×100 mm），隨后相關實驗以12 h：12 h=光照：黑暗培養，開展實驗。

1.2 生防菌菌懸液防效測定

試驗設5.0×107CFU/mL 生防菌PP19 和SI17菌懸液，以及0.85% NaCl 10 倍液3 個處理。采用噴霧處理的方法，24 h 后噴霧接種P.litchii。室溫25 ℃培養。每個處理3 次重復，每個重復30 個果實。接種病原菌后24 h 開始調查病害嚴重度。根據蔡學清［13］病害嚴重度調查方法稍加改善：0 級：無病癥；1 級：接種點有輕微病斑,壞死面積5%以下；3 級：壞死面積5%～10%；5 級：壞死面積10%～25%；7 級：壞死面積25%～50%；9 級：壞死面積超過50%或全部白霉（果實）。計算病情指數和防治效果：

病情指數（%）=〔∑（病級數×該病級果數）/（最高病級×總果數）〕×100

防治效果（%）=〔（對照病情指數 -處理病情指數）/對照病情指數〕×100

1.3 抗病酶活性和相關物質含量測定

樣品處理方法同1.2。取樣時間點為接種后0、12、24、36、48、60、72 h。去掉果肉，果皮迅速分裝在錫箔紙中，液氮速凍25～30 min，放置在-80 ℃冰箱保存，備用。每個處理每次取樣總計9 個果實（3 次重復，每個重復3 個果實）。抗病酶活性和相關物質含量指標分為3 類：（1）保護酶和物質含量：超氧化物歧化酶（SOD，superoxide dismutase）、過氧化氫酶（CAT，catalase）、H2O2；（2）抗病酶：β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucansae，GLU）、幾丁質酶（chitinase，CHI）、苯丙氨酸解氨酶（PAL，phenylalanin ammonia-lyase）、過氧化物酶（POD，peroxidase）；（3）保鮮相關酶或物質含量：多酚氧化酶（PPO，polyphenol oxidase）、總酚（total phenolic）、花色素苷（anthocyanin）、花色素苷酶（anthocyanase）。測定采用全波長酶標儀（Multiskan Go-1510）或分光光度計。

1.3.1 保護酶和物質含量測定 H2O2：采用試劑盒法檢測（南京建成生物工程有限公司），檢測OD405。SOD：參考余中蓮的方法測定［29］，測定OD560。CAT：參照余中蓮［29］的方法測定，提取荔枝果皮樣品的粗酶液，測定OD405。

1.3.2 抗病酶測定 GLU：采用試劑盒法檢測（北京索萊寶科技有限公司），測定OD540值。CHI：參考余中蓮的方法測定［29］，測定OD585。PAL：采用試劑盒法檢測（南京建成生物工程有限公司），1 cm 光徑石英比色皿，雙蒸水調零，測定OD290。POD：采用試劑盒法檢測（南京建成生物工程有限公司），雙蒸水調零，1 cm 光徑比色皿，測定OD420。PPO：參照余中蓮［29］的方法測定，測定OD398。

1.3.3 其他酶或物質測定 總酚（total phenolic）：參照蔡學清［13］的方法，用Folin-Ciocalteu 法測定，繪制標準曲線，測定OD700。花色素苷（anthocyanin）：參照蔡學清［13］的方法，測定OD510。花色素苷酶（anthocyanase）：參照蔡學清［13］的方法，測定OD530。

1.4 數據統計與分析

在Microsoft Excel 中對病情指數、生防效果、酶活性及物質含量等數據進行處理、分析。采用DPS 軟件7.05 進行LSDTest（P＜0.05），ANOVA Analysis 進行各個因子的單因素（Oneway）分析。

2 結果與分析

2.1 菌懸液對荔枝霜疫病的生防效果分析

PP19 和SI17 菌懸液分別預處理荔枝果實，接種后36、48、60 h，果實病情指數分別為1.23%、4.98%、32.59% 和0.99%、6.79%、44.20%（圖1A）；生防效果分別為88.76%、80.41%、39.59%和91.01%、73.30%、18.08%（圖1B）。與對照相比，兩株生防菌菌懸液接種后36、48 h 顯著降低妃子笑荔枝果實霜疫病的發生；但接種后60 h 與對照差異不顯著（圖1）。

圖1 PP19 和SI17 菌懸液處理后荔枝果實 的病情指數和生防效果Fig.1 Disease index and biocontrol efficacy of litchi fruit treated with bacterial suspensions of PP19 and SI17

2.2 菌懸液對荔枝果皮相關酶活性和物質含量的影響

PP19 和SI17 菌懸液預處理果實24 h 接種P.litchii，檢測11 種相關指標。數據分析顯示，它們和對照存在差異；后期隨著果實褐變和病情加重，各指標活性或含量均呈現下降趨勢。

2.2.1 菌懸液對果皮H2O2含量、CAT 和SOD活性分析 結果（圖2）顯示，H2O2含量呈現“下降-上升-下降”趨勢，均在24 h 含量最高，隨后都下降；對照果皮H2O2含量下降斜率最高，其次為PP19，且在24 h 下降幅度達18.92%，其他時間點含量均增加，最高可達74.05%（72 h）；SI17處理果皮H2O2含量在24～48 h 下降最高，分別為22.58%和21.36%，72 h 增加58.05%。并且，在0～24 h（無病原菌）時，三者差異較小；24～72 h（接種霜疫霉菌）的含量均下降，但PP19 含量高于對照，可能此過程具有保護細胞的功能。PP19 和SI17 處理果實后，CAT 活性在48～72 h 高于對照，而24～48 h 的兩個處理和對照的變化趨勢較為相似，呈現“平穩-上升-下降-上升”。PP19和SI17 處理后，果皮CAT 活性僅在48～72 h 增幅較大（60 h 分別增加15.65%和19.75%）。PP19和SI17 處理果實，在24～48 h 果皮SOD 活性顯著高于對照，隨后相似，趨勢為“下降-上升-下降”，36 h 分別增加18.89%和17.35%。PP19 和SI17 菌懸液處理可提高果實的CAT、SOD 活性，接種霜疫霉后果皮的H2O2含量表現增加，可能激發了果皮的抗病性。

圖2 PP19 和SI17 菌懸液對荔枝果皮H2O2 含量及CAT、SOD 活性的影響 Fig.2 Effects of bacterial suspensions of PP19 and SI17 on the content of H2O2 content and CAT,SOD activity in litchi fruit peel

2.2.2 菌懸液對果皮GLU、CHI 和PAL 活性分析 PP19 菌懸液預處理果皮，結果（圖3）顯示，接種后36～60 h 顯著提高果皮GLU 活性（分別增加200%、92.23%和7.84%），而SI17 則在12～36 h 表現更優（分別增加89.13%、651.18%、184.62%），變化趨勢均為“上升-下降-上升-下降”。PP19 和SI17 菌懸液對CHI 活性影響較小，在病原菌侵染后期60～72 h 可提高其活性，SI17在48 h 活性表現最高（增加12.36%），48～72 h 下降幅度和對照無差異，PP19 在60～72 h 其活性高于對照（分別增加95.29%和43.63%），且在0～24 h CHI 活性和對照無差異；三者變化趨勢相似，為“上升-下降-上升-下降”。PP19 和SI17 處理果皮PAL 活性呈現相似趨勢“，為上升-下降-上升/下降”，PP19 在24～36 h（分別增加11.44%和12.96%）和60～72 h（分別增加5.55%和166.90%）活性高于對照，SI17 則在60～72 h高于對照（分別增加16.94%和169.54%），二者均提高PAL 活性。

圖3 PP19 和SI17 菌懸液對荔枝果皮GLU、CHI 和PAL 活性的影響 Fig.3 Effects of bacterial suspensions of PP19 and SI17 on the activity of GLU,CHI and PAL in litchi fruit peel

2.2.3 菌懸液對果皮POD 和PPO 活性分析 POD 和PPO 均表現為對照果皮酶活性高于PP19和SI17 處理，其中PP19 處理對2 種酶影響更大，下降趨勢更為顯著（變化斜率更大）。PP19 和SI17 處理果皮POD 活性在24、60、72 h 分別減少24.96%、25.10%、31.39%和4.73%、20.68%、30.87%，三者變化趨勢相似為“下降-上升”；而PP19 處理果皮PPO 活性在24、48 h 分別減少37.18%和93.75%，SI17 處理果皮PPO 活性在24、48、60 h 分別減少50%、62.50%、30.16%，三者變化趨勢相似為“下降-上升-下降”（圖4）。

圖4 PP19 和SI17 菌懸液對荔枝果皮POD 和PPO 活性的影響 Fig.4 Effects of bacterial suspensions of PP19 and SI17 on the activity of POD and PPO in litchi fruit peel

2.2.4 生防菌對果皮總酚和花色素苷含量及花色素苷酶分析 和褐變有關的酶和物質主要有總酚、花色素苷和花色素苷酶。結果（圖5）顯示，菌懸液可增加總酚和花色素苷含量（48、60 h 和24、36 h 高于對照）。PP19 處理可降低花色素苷酶活性（36～60 h），SI17處理后期活性也低于對照，但變化斜率高于PP19 處理的果皮，顯示PP19 處理更利于降低果皮花色素苷酶活性。PP19 處理果皮總酚在48、60 h 分別增加13.29%和9.68%，在36 h 下降5.39%；SI17 處理果皮在60 h 增加28.59%，其他時間點總酚含量低于對照，其中在36 h 下降20.21%，三者變化趨勢相似，均呈現“下降”。PP19 處理果皮花色素苷含量和花色素苷酶活性在36 h 增加124%、48 h 減少78.52%，SI17處理則在72 h 增加55%、48 h 減少31.17%，花色素苷變化趨勢為“下降-上升-下降”，花色素苷酶變化趨勢為“下降-上升-下降”。

圖5 PP19 和SI17 菌懸液對荔枝果皮總酚和花色素苷含量及花色素苷酶活性的影響 Fig.5 Effects of bacterial suspensions of PP19 and SI17 on the content of total phenolic and activity of anthocyanin and anthocyanase in litchi fruit peel

3 討論

生物防治由于其高效持久、環境友好以及無藥劑殘留的特點被廣泛用于防治植物病害，成為防治植物病害的主流研究方向［30］。而生防菌作為一種生物防治的方法，常被用于誘導果實提高自身的抗病性［31-32］。當植物受到病原菌入侵時，體內多種與抗病性有關的酶會參與其中，這些酶作為衡量植物抗病性能力的指標，主要包括PAL、SOD、PPO、CAT、POD 等，受到外界生物或者非生物脅迫時植物體內防御酶體系就會被啟動［33-35］，從而延緩果實劣變［36］、提高植株抗病性［37-38］以及限制病害的擴展［39］。本研究發現，PP19 和SI17 菌懸液能顯著降低荔枝果實霜疫病的發生，且能改變相關抗病保鮮酶的活性。接種后12、36、48 h，生防菌處理抗病相關酶（GLU、CHI、POD、PAL）活性稍高于對照；PP19 接種后72 h CAT 活性高于對照，SOD 活性在36 h 高于對照。接種后12～48 h，生防菌處理總酚、花色素苷含量高于對照；PP19 和SI17 對荔枝果皮酶活性影響不完全相同，對酶活性的影響存在差異，如SI17 比PP19 更能提高植物CHI 活性；PP19 處理果皮H2O2含量下降較多；SI17 和PP19 從48 h開始可降低花色素苷酶活性。

本實驗數據POD 活性（生防菌處理后POD活性低于對照）和蔡學清［13］報道的研究結果不完全一致，其研究數據顯示內生菌處理后荔枝果皮POD 活性大于對照。關于POD 活性變化趨勢，目前并無統一定論，也有文獻報道其含量越低越好，其可能參與酚的氧化，活性越高越容易使果皮褐變；但也有研究認為其活性可能與植物抗病相關，比如參與了植物的木質化過程［40］。由此推測，本實驗中生防菌處理果皮POD 可能主要影響了果皮褐變過程。

在病原菌脅迫下，PP19 處理果皮H2O2含量下降較多，對荔枝果實起保護作用；生防菌可提前增加總酚、花色素苷含量（12～48 h 高于對照）；SI17 和PP19 從48 h 開始可降低花色素苷酶活性，前期（12～36 h）絕對含量雖然高于對照，但變化斜率低于對照，故對照對花色素苷影響更大，導致其含量比生防菌處理的要低。但隨著果實褐變和病情加重，活性或含量均表現下降。此研究數據和文獻報道保持一致［13，29］。

4 結論

生防菌PP19 和SI17 菌懸液噴霧預處理荔枝果實后，可顯著降低采后荔枝霜疫病的發生；它們處理果實后，可能通過改變果皮相關抗病保鮮酶活性或物質含量起到防病保鮮效果。菌懸液處理果實后，影響果皮CAT、SOD、GLU、PAL、PPO、POD、花色素苷酶的活性和總酚及花色素苷含量；SI17 比PP19 更能提高果皮CHI 活性；PP19 對果皮酶活性或相關物質含量影響更大。在下一步研究中，我們將進一步分析兩株菌菌懸液對調控酶活性或活性物質相關基因表達的定量分析，深入揭示菌懸液防病的作用機制。