阿魏酸對抗生素應激小鼠血清抗氧化性及其腸道微生物的影響

李 英，吳慶華，楊華林，李 利，余知和，王 允

（長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025）

【研究意義】植物多酚是廣泛存在于植物體內的具有大量酚羥基結構單元的植物次生代謝產物，在傳統工業中具有多種用途。近年來多酚的結構已被深入揭示［1］。多酚主要包括阿魏酸、水楊酸、咖啡酸等小分子酚酸類物質、黃酮類物質以及單寧類大分子物質，在谷類、蔬菜、水果、茶和紅酒等日常食品中廣泛存在膳食多酚。膳食多酚中最常見的酚酸類物質主要包括咖啡酸和阿魏酸，咖啡酸主要存在于蔬菜、水果中，而阿魏酸則主要存在于麥麩等谷類物質中［2］。阿魏酸是桂皮酸的衍生物，在植物細胞壁中與多糖和蛋白質結合，雖然含量很大，但不容易釋放，需要經過消化或微生物水解后才可以被利用，因此膳食中的阿魏酸并沒有被充分利用。研究表明，膳食多酚具有抗氧化、促進損傷修復、消炎、解毒、增強免疫功能等多種生物學活性，攝入富含多酚類的食物可降低多種慢性疾病的發生［3-5］。

【前人研究進展】腸道微生物能夠合成人體生長發育所必需的維生素，并參與糖類、蛋白質和脂肪的代謝。菌群組成在體內維持平衡，一旦失衡會引起多種疾病［6-8］。研究表明，腸道微生物與動物及人類的健康關系密切，與肥胖、炎癥反應、免疫調節和癌癥治療甚至與嬰兒的智商和精神類疾病相關［9-11］。在不同條件下，腸道菌群的組成存在微妙的變化。研究發現，過度肥胖患者的腸道中壁厚菌門與變形菌門的豐度比顯著提高［12-13］。而腸炎患者、腸易激綜合征患者的腸道微生物總量升高，多樣性顯著降低，壁厚菌門與變形菌門的豐度比明顯降低［14-15］。IIllumina 測序方法確保了高精確度和真實的單堿基連續測序，為同重復序列的測定提供了很好的解決方案，能夠在不同水平上對環境微生物的組成進行分析［16］。

腸道菌群維持在一種動態平衡狀態，抗生素濫用會破壞種群平衡，增加炎癥性疾病風險。酚類物質因其復雜的結構和聚合度，在小腸吸收量非常小，大部分多酚類物質會在結腸內微生物的作用下被消化并被機體吸收［17］。不同多酚類物質對不同菌群增殖有促進或抑制作用，從而對腸道菌群的結構和數量產生影響。果蔬多酚、茶多酚中的兒茶素以及蛋白核小球藻的活性生長因子均能促進益生菌生長，抑制類桿菌、葡萄球菌等有害菌生長，調節腸道菌群平衡，從而對人體的健康起調節作用［18］。【本研究切入點】多酚與腸道微生物存在相互促進作用，一方面膳食多酚可促進益生菌生長，抑制有害菌增殖，另一方面益生菌產生的益生元又能促進多酚在結腸中的吸收。目前，關于多酚與腸道微生物的相互作用研究比較多，但有關多酚對抗生素應激狀態下動物的腸道微生物影響還未見報道。【擬解決的關鍵問題】本試驗主要通過各種試劑盒檢測小鼠血清中的生化和氧化相關酶類指標，并利用高通量測序分析其腸道微生物群落，研究了谷類多酚的主要物質阿魏酸對抗生素應激小鼠的血清抗氧化性及其腸道微生物群落多樣性的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

阿魏酸、土霉素、紅霉素、頭孢羥氨芐，購自上海Macklin 生化科技有限公司（中國）；血清總蛋白試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、過氧化氫酶（CAT）試劑盒、總超氧化物歧化酶（T-SOD）試劑盒、谷胱甘肽（GSH-PX）試劑盒、抗氧化活性（T-AOC）試劑盒、一氧化氮合酶（T-NOS）試劑盒、誘導型一氧化氮合酶（I-NOS）試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。QIAamp DNA Stool Mini Kit，購自Qiagen 公司（德國）；其他試劑為國產分析純。30 只42 日齡KM 雄性小鼠，體重20（±2）g，由廣東省動物實驗中心提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗分組處理 試驗于2020 年11 月在湖北省長江大學生命科學學院進行。30 只KM 雄性小鼠在溫度20～22 ℃、濕度45%～55%的無菌潔凈環境中適應喂養1 周后，隨機分為對照組、抗生素組、抗生素+阿魏酸組。每天灌喂對照組和抗生素組小鼠去離子水500 mg/kg，灌喂抗生素+阿魏酸組小鼠阿魏酸500 mg/kg，持續灌喂4 周，每天保持正常飲水與進食。第5 周開始在給予抗生素+阿魏酸組小鼠阿魏酸的同時，給抗生素組、抗生素+阿魏酸組灌喂混合抗生素，小鼠每天攝入的混合抗生素包含頭孢羥氨芐100 mg/kg、土霉素300 mg/kg、紅霉素300 mg/kg，每天灌喂1 次，連續灌喂7 d，每天保持正常飲水與進食。

1.2.2 樣品采集 試驗35 d 后剪掉小鼠胡須，摘除眼球采血，頸椎脫臼處死小鼠，并解剖取肝臟、脾臟、盲腸及其內容物。用1.5 mL 離心管從小鼠左右眼眶處接取原血，冷凍離心機3 500 r/min 離心10 min 后取上清液即為血清。解剖取出小鼠脾臟，立即放入0.9%生理鹽水中洗凈，并分別放進5 mL 離心管中置于冰上備用。新鮮取出的盲腸立即用5 mL 離心管盛裝并置于冰上，取出內容物放入錫箔紙，并裝入5 mL 離心管，液氮速凍，置于-80 ℃冰箱中保存，備用。

1.2.3 生化指標和抗氧化指標測定 測定小鼠的血清總蛋白、T-AOC、CAT、T-SOD、GSH-PX、MDA、T-NOS、I-NOS，嚴格按照各試劑盒說明操作，并計算各指標值。

1.2.4 小鼠腸道菌群鑒定 每組各取5 只小鼠的盲腸，將待測樣品交派森諾生物科技有限公司（中國）進行腸道菌群鑒定分析。流程如下：首先提取樣品細菌總DNA，然后以微生物核糖體RNA目標序列為靶點，設計16S rDNA 的V3～V4 區的特異性引物，等溫擴增構建文庫。構建好的文庫經梯度稀釋，利用Illumina MiSeq 測序平臺進行高通量測序，每組做4 次重復。

1.2.5 高通量測序數據分析處理 測序數據先通過QIIME 軟件識別疑問序列，剔除不合格的序列。隨后用USEARCH 軟件檢查并剔除嵌合體序列。通過UCLUST 軟件對獲得的合格序列以97%的序列相似度進行操作分類單位（Operational taxonomic unit，OTU）劃分，獲得每個OTU 分類學信息［19］。并利用R 軟件進行樣本的Alpha 多樣性分析及基于UniFrac 距離的PCoA 主坐標分析，對小鼠腸道微生物進行菌群比較和關鍵物種篩選。

1.3 數據分析

所有試驗進行3 次平行試驗。試驗數據利用SPSS13.0 軟件進行方差分析，并通過Tukey’s 進行多重比較。當P＜0.05 則認為具有統計學顯著差異。

2 結果與分析

2.1 阿魏酸對小鼠體重的影響

經過適應性喂養1 周后，各組小鼠的攝食量和平均體重如圖1 所示。試驗期間，各組小鼠的攝食量無明顯差異，體重呈現穩步增長的趨勢。與對照組相比，灌喂膳食多酚阿魏酸的小鼠體重無明顯差異，說明在正常飲食的情況下，多酚對小鼠體重無顯著影響。在第5 周開始對抗生素組和抗生素+阿魏酸組小鼠灌喂抗生素，抗生素組小鼠體重略微下降，但與對照組和抗生素+阿魏酸組小鼠的體重無顯著差異。脾臟是重要的免疫器官，免疫器官指數是評價動物免疫狀況的關鍵指標之一，本研究參考甘霓等［20］的方法計算對照組、抗生素組、抗生素+阿魏酸組小鼠的脾臟指數，分別為5.38±0.18、4.28±0.22、5.54±0.63 mg/g。抗生素應激小鼠的脾臟指數顯著低于對照組，說明抗生素對小鼠免疫系統產生了一定影響，而加入阿魏酸飼喂，小鼠的脾臟指數得到了一定程度的恢復。

圖1 不同處理小鼠的攝食量和平均體重變化Fig.1 Changes of food intake and average body weight of mice in different groups

2.2 阿魏酸對小鼠血清抗氧化性的影響

試驗35 d 后分別取對照組、抗生素組和抗生素+阿魏酸組小鼠的血清測定血清總蛋白、T-AOC、CAT、T-SOD、GSH-PX、MDA、T-NOS和I-NOS 等指標。血清總蛋白來自食物吸收和肝臟合成，其功能是維持血液滲透壓，并與物質運輸，尤其是脂類轉運功能相關。本研究3 個處理組小鼠的血清總蛋白含量沒有顯著差異（圖2A）。由圖2B 可知，抗生素組小鼠的總抗氧化能力相比于對照顯著下降，而抗生素+阿魏酸組與對照無顯著差異，相比抗生素組提高了56.36%。為明確具體哪些抗氧化因子與總抗氧化性的恢復相關，進一步測定CAT、T-SOD、GSHPX、MDA（圖2C～F）。CAT 在不同處理中無顯著差異，而T-SOD 和GSH-PX 在抗生素組中的活性明顯降低，阿魏酸對小鼠抗生素的負荷起到顯著的改善效果，而且相比對照組，抗生素+阿魏酸組的T-SOD 和GSH-PX 活性還分別提高20.50%和26.27%。此外，相比對照組，抗生素組小鼠血清中的MDA 含量提升87.76%。

圖2 阿魏酸對抗生素應激小鼠血清抗氧化性的影響Fig.2 Effect of ferulic acid on serum antioxidation in antibiotic stressed mice

T-NOS 有3 種亞型同功酶，分別為神經元型一氧化氮合酶（N-NOS）、內皮型一氧化氮合酶（E-OS）和誘導型一氧化氮合酶（I-NOS）。I-NOS僅在損傷后誘導表達，激活后可誘導動物持續大量釋放過量的一氧化氮，活性氮氧增多引起脂質過氧化，誘發炎癥反應［21］。由圖2G、H 可知，無論T-NOS 還是I-NOS 在不同處理組中均表現出相同趨勢，相對于對照組，抗生素組兩種酶的活性分別提高了32.36%和85.89%，而抗生素+阿魏酸組能夠顯著消除抗生素所帶來的影響，與對照組無顯著差異。

2.3 小鼠腸道菌群的Alpha 多樣性分析

本試驗分別隨機選取了對照組、抗生素組和抗生素+阿魏酸組小鼠盲腸內容物通過Illumina MiSeq 測序平臺進行高通量測序。ACE 估計指數和Chao1 估計指數側重于描述群落的豐富度，指數越高表明群落的豐富度越高。Simpson 指數和Shannon 指數更側重于描述群落的多樣性，指數越高表明其多樣性越高。而本研究得到對照組、抗生素組和抗生素+阿魏酸組的Chao1 指數分別為1 362.44、333.75 和299.01，Shannon 指數分別為7.71、3.70 和4.41。可見，抗生素組相對于對照組的Chao1 指數和Shannon 指數均顯著降低，且抗生素+阿魏酸組與抗生素組無顯著差異。結果表明，抗生素應激小鼠的腸道微生物的豐度和多樣性均下降，而添加阿魏酸并未能改善抗生素應激的影響。由圖3 可見，抗生素組和抗生素+阿魏酸組的OUT 受抗生素影響，且相比于對照組有明顯降低，抗生素組和抗生素+阿魏酸組仍然具有259、215 個獨有的OUT，這揭示了抗生素和阿魏酸可能對小鼠腸道微生物群落的具體組成產生影響。

圖3 小鼠腸道菌群OTU 的Venn 圖Fig.3 Venn map of intestinal microflora in mice

2.4 小鼠腸道菌群的Beta 多樣性分析

為分析不同樣本之間的群落結構相似性，對小鼠腸道菌群進行Beta 多樣性分析，通過比較群落各自獨有OTU 之間的系統發育關系，反映微生物群落之間的相似度。UniFrac 距離有Unweighted和Weighted 兩種，Unweighted 僅表示OTU 在樣本中是否存在，而Weighted 則兼顧群落組分之間的系統發育關系和豐度。由圖4 可見，腸道菌群結構相近的樣本有聚集的傾向，說明群落成員組成和豐度均存在顯著性差異。

圖4 小鼠腸道菌群Unweighted UniFrac 距離（A）和Weighted UniFrac 距離（B）的PCoA 主坐標分析Fig.4 PCoA plots of Unweighted UniFrac distance values（A）and Weighted UniFrac distance values（B）of intestinal microflora in mice

2.5 小鼠腸道微生物菌群結構分析

在門水平上，硬壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和TM7 門微生物占微生物總量的98.6%。抗生素組的擬桿菌門、TM7 門微生物在抗生素的作用下幾乎消失，抗生素+阿魏酸組相比于抗生素組，硬壁菌門、變形菌門的豐度比值發生了變化（圖5）。在屬水平上，由于Illumina MiSeq 測序長度的限制，導致很多腸道微生物不能鑒定至屬，因此大量的屬被歸類在其他組內。由圖5 可以看出，對照組的群落組成具有多樣性，而抗生素組和抗生素+阿魏酸組則較為單一，優勢屬分別為腸球菌屬（Enterococcus）、梭菌屬（Clostridium）和檸檬酸桿菌屬（Citrobacter），相比于抗生素組，抗生素+阿魏酸組的梭菌屬豐度顯著提升。

圖5 小鼠腸道微生物在門（A）和屬（B）水平上的相對豐度Fig.5 Relative abundance of intestinal microflora in mice at the phylum（A）and genus（B）level

2.6 小鼠腸道微生物菌群差異物種比較

采用Metastats 算法［22］，分別在門和屬水平上對OTU 的組間絕對豐度差異進行兩兩比較，結果（表1）顯示，在門水平上，對照組與抗生素組有4 個門存在差異，對照組與抗生素+阿魏酸組有5 個門存在差異，而抗生素組與抗生素+阿魏酸組間無差異；在屬水平上，對照組與抗生素組有16 個屬存在差異，對照組與抗生素+阿魏酸組有20 個屬存在差異，抗生素組與抗生素+阿魏酸組有14 個屬存在差異。圖6 所示為屬水平上對照組、抗生素組和抗生素+阿魏酸組之間差異最顯著的前20 個OTU 的小提琴圖。抗生素組和抗生素+阿魏酸組有存在顯著差異的14 個屬包括梭菌屬（Clostridium）、腸球菌屬（Enterococcus）、沙雷菌屬（Serratia）、毛球菌屬（Trichococcus）、變形桿菌屬（Proteus）、異葉藻屬（Isobaculum）、污水菌屬（Aquamicrobium）、鞘脂菌屬（Sphingobium）、腸桿菌屬（Enterobacter）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、費克藍姆菌屬（Facklamia）、短 桿 菌 屬（Brevibacterium）、芽胞八疊球菌屬（Sporosarcina）和棒桿菌屬（Corynebacterium）。

圖6 小鼠腸道微生物菌群組間屬水平差異最顯著的前20 個OTU 豐度分布Fig.6 Abundance distribution of 20 OTU with the most significant difference at genus level among different groups of intestinal microflora in mice

表1 小鼠腸道微生物菌群組間的Metastats兩兩比較檢驗結果統計Table 1 Statistics of Metastats pairwise comparison test results between different groups of intestinal microflora in mice

3 討論

3.1 阿魏酸對抗生素應激小鼠生長和抗氧化能力的影響

本研究供試的3 組小鼠在體重變化趨勢上無明顯差異，進行抗生素灌喂前小鼠活躍好動，有互相打架現象，飲食量各組間無顯著差異，糞便呈黑色、較硬。抗生素灌喂后，抗生素組出現嗜睡、懶動的癥狀，糞便呈米黃色、軟糯；抗生素+阿魏酸組可能由于有膳食多酚的干預，相比抗生素組更為活躍。

自由基的過氧化效應與基因突變、色素形成、組織硬化、細胞損傷有關。動物機體具有氧化還原酶及防護系統，在終止過氧化的同時修復組織和細胞。機體的抗氧化系統是一個復雜且完善的系統，而抗生素濫用會破壞腸道微生物種群平衡，進而影響機體的抗氧化性及其他機能，增加各類疾病風險。T-AOC 可直接反映機體抗氧化能力。CAT 是生物體內主要的抗氧化酶之一，能夠催化過氧化氫分解生成氧氣和水，T-SOD 對機體的氧化與抗氧化平衡起至關重要的作用，能清除氧離子自由基，從而保護細胞免受氧離子的傷害。GSH-PX 蛋白具有清除脂質過氧化物的功能，可以通過其酶活性降低脂質過氧化物的毒性，維持膜脂質雙分子層的穩態。本研究抗生素組小鼠連續1 周混合抗生素飼喂后，小鼠的總抗氧化能力T-AOC 減弱，說明抗生素會導致小鼠脂質氧化進而影響其代謝功能，而使用膳食多酚阿魏酸能夠使其血液脂質氧化水平維持在對照組相近水平，降低抗生素所帶來的部分負面影響。抗生素+阿魏酸組的T-SOD 和GSH-PX 活性與對照組相近，說明攝入一定時間阿魏酸后小鼠可以通過提高T-SOD 和GSH-PX 活性顯著提高其血液的抗氧化能力。機體在逆境下往往發生膜脂過氧化反應，MDA 是膜脂過氧化的最終分解產物，其含量可以反映損傷程度。MDA 從膜上產生，改變膜的通透性，使得細胞膜結構和功能受到損傷，釋放后可以使體內活性物質喪失功能，包括抑制蛋白質合成。抗生素使小鼠體內的MDA 含量提升了87.76%，這種負面影響能夠通過多酚阿魏酸的攝入恢復至對照水平。

3.2 阿魏酸對NO 信號的影響

NO 是細胞中的抑制性信號分子之一，作用于腸道平滑肌，能夠抑制腸道的收縮蠕動［23-24］。作為信使分子，NO 在動物體內的功能多樣，包括促進血管擴張、抑制血小板聚集、抑制細胞增殖，對細胞凋亡具有雙重影響，還與糖尿病、心血管疾病、癌癥等相關［25］。在氧化應激或炎癥等情況下，細胞內的一氧化氮合酶（NOS）可持續催化合成大量的NO，高濃度的NO 參與氧化應激、炎癥反應以及免疫信號傳導，在不同濃度下能夠對機體產生多方面影響［26］。王建民等［27］研究顯示，通過特定的藥物可使大鼠血清中的NO、NOS 水平顯著提升，而通過中藥益氣健脾干預治療后，大鼠的排泄癥狀得到明顯改善，相應的信號分子NO 的含量及NOS 的活性顯著降低。本研究結果與該結論相符，受抗生素影響，T-NOS和I-NOS 的水平明顯上升，膳食多酚阿魏酸干預能夠降低小鼠受抗生素的影響，糞便由米黃色、軟糯轉變為黑色、較硬的正常狀態，且小鼠運動活力明顯恢復，與對照小鼠無明顯差異。

3.3 阿魏酸對小鼠腸道微生物群落組成的影響

腸道菌群微生態失衡會引起機體出現免疫性疾病、代謝性疾病和消化性疾病，多酚對維持腸道微環境的穩態有較大作用［28-29］。小鼠的胃和小腸細菌相對較少，盲腸內空物中主要以兼性厭氧菌為主，是微生物最豐富的位置，微生物的構成和糞便微生物的組成更接近，在腸道群落的分析方面具有一定代表性。本研究對小鼠腸道微生物的16S rDNA 進行高通量測序，Alpha 多樣性分析表明，抗生素的使用使小鼠腸道微生物的豐度和多樣性顯著降低，阿魏酸的攝入并未改變樣品的豐度和多樣性，進一步的Beta 多樣性分析顯示，腸道菌群結構相近的樣本有聚集的傾向，說明群落成員在樣品組成上存在差異。抗生素的使用導致擬桿菌門和TM7 門的微生物基本消失，阿魏酸的攝入使抗生素應激小鼠體內的厚壁菌門與變形菌門的豐度比顯著降低。Méndez-Salazar 等［30］也發現，厚壁菌門與變形菌門的豐度比與糖脂代謝和炎癥反應相關，該豐度比值高時表明腸道菌群豐度較低，反之菌群豐度較高，且與脂代謝相關。TM7 是發現于自然環境中的革蘭氏陽性不可培養細菌的一個亞群，據報道TM7 的增殖與炎癥反應具有重要關聯［31］。本研究在屬水平上可明顯觀察到，阿魏酸使抗生素應激小鼠的梭菌屬豐度顯著增加。賈增增［32］研究發現，梭菌屬能夠通過調節腸道內5-羥色胺的含量進而對消化過程起促進作用。

本研究樣品組間差異性分析結果展示了在屬水平上樣本組間差異最顯著的前20 個OTU 的豐度分布結果。芽胞八疊球菌屬能夠產生甘露聚糖酶、果膠酶等多種酶，并有報道其與白云石晶體形成相關［33］。本研究發現抗生素+阿魏酸組相對于抗生素組對菌群物種組成有明顯的調節作用。腸球菌屬是腸道內常見的一種條件致病菌，適量的菌體能發酵乳糖產乳酸，但當機體免疫缺陷時會引起化膿感染［34］。由于其對多種抗生素表現出固有耐藥性，抗生素組和抗生素+阿魏酸組的腸球菌屬豐度相比于對照均顯著提高，且抗生素+阿魏酸組的豐度又顯著低于抗生素組，說明阿魏酸可能通過抑制腸球菌屬的過度增殖達到抑制腸道感染的作用。抗生素+阿魏酸組的變形桿菌屬豐度相對其他兩組均有顯著提高，變形桿菌屬為腸道正常菌群，一般情況不致病，在無氧環境下能夠發酵纖維素和低聚寡糖產生短鏈脂肪酸，其丙酸、丁酸等能夠對腸道的代謝和炎癥反應產生積極影響［35］。

4 結論

阿魏酸能夠顯著消除抗生素所帶來的部分負面影響，包括上調多種與抗氧化活性相關的基因，使小鼠總抗氧化性水平相比抗生素組提高了56.36%，降低體內脂質氧化水平，并通過NOS 調控NO 的合成，刺激腸道收縮蠕動而促進消化。抗生素使小鼠的脾臟指數降低（4.28±0.22 mg/g），而阿魏酸使脾臟指數恢復至與對照組相近的水平（5.54±0.63 mg/g），說明阿魏酸對免疫器官起一定的正調節作用。抗生素對小鼠的腸道微生物群落結構產生較大影響，導致腸道微生物群落的豐度和多樣性均顯著降低，阿魏酸能夠通過提高變形菌門與厚壁菌門的豐度比例，顯著提高梭菌屬并降低芽胞八疊球菌屬和腸桿菌屬豐度等多種方式，對腸道代謝、腸道微生態平衡和炎癥反應等進行調控。本研究結果為阿魏酸作為改善因抗生素導致機體抗氧化能力降低及菌群失調的微生態制劑提供了理論基礎。