龜紋瓢蟲生殖系統及卵子發生觀察

劉志偉，鐘國輝，王永躍，王興民，畢可可

（1.廣州市林業和園林科學研究院，廣東 廣州 501405；2.龍門縣林業局，廣東 龍門 516800；3.華南農業大學生物防治教育部工程研究中心，廣東 廣州 510642）

【研究意義】龜紋瓢蟲（Propylea japonica）屬鞘翅目瓢蟲科瓢蟲族龜紋瓢蟲屬，廣泛分布于我國南北各地［1］，是蚜蟲的重要天敵［2-4］，也捕食蚧殼蟲、草地貪夜蛾、木虱［5-7］，具有耐高溫、繁殖力強、對多種農藥表現高耐受性等優點［8-10］，是農林業重要天敵昆蟲，具有很大的開發應用前景。要實現龜紋瓢蟲大規模生物防治，人工繁殖非常重要，而生殖系統和卵子發生相關研究將為人工繁殖提供理論依據。【前人研究進展】昆蟲卵巢管有無滋式和具滋式兩種類型［11］，其中具滋式又劃分為端滋式和多滋式［12］。無滋式指卵巢管內無滋養細胞，濾泡細胞和血淋巴為卵細胞發育提供營養物質和RNA，少量營養物質由卵細胞自身合［13-14］。端滋式卵巢管中，滋養細胞集中在卵巢管前段的生殖區，通過營養索向卵母細胞輸送營養物質［15］。多滋式卵巢管中，濾泡細胞分布在整個卵巢管，通過胞內連絲將營養物質和RNA 輸入卵母細胞［14］。國內外對瓢蟲生殖系統和卵子發生已有研究，Mpakou 等［16］闡述了二星瓢蟲（Adalia bipunctata Linnaeus）卵子發生過程中細胞凋亡的3 種類型，分別為細胞程序死亡、細胞自噬和細胞質死亡；Maffei 等［17］發現Eriopis connexa為端滋式卵巢管；Osawa［18］研究了在食物匱乏情況下，異色瓢蟲卵巢管重新吸收卵細胞；陳潔等［19］根據卵母細胞所在位置、體積、形態和細胞核的變化，滋養細胞和濾泡細胞的形態變化，以及卵黃沉積、分布情況將異色瓢蟲（Harmonia axyridis Pallas）卵子發生劃分為3 個時期7 個階段；此外，小黑瓢蟲（Delphastus catalinae）、七星瓢蟲（Coccinella septempunctataL.）、孟氏隱唇瓢蟲（Cryptolaemus montrouzieri）也有生殖系統觀察研究［20-22］。【本研究切入點】有關龜紋瓢蟲的研究由來已久，主要在生物防治［23］、耐藥性［10,24］、人工飼料［25］等方面，但還未形成規模化的生物防治應用，大量繁殖是實現生物防治應用的基礎，而研究相對匱乏的生殖系統對繁殖非常重要。【擬解決的關鍵問題】本研究在張天澍等［26］研究的基礎上，結合查閱相關資料，應用組織解剖和石蠟切片技術，補充雌雄生殖系統攝像，以及更加清晰的卵子發生過程觀察結果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

龜紋瓢蟲采自廣東省內，實驗條件（光照12 h、黑暗12 h，溫度26±1℃，濕度75%～80%）下用蚜蟲飼養。

Ring’s 生理鹽水：20%氯化鈉，10%氯化鉀，10%氯化鈣，5%碳酸氫鈉，1%磷酸二氫鈉。

1.2 試驗方法

1.2.1 生殖系統解剖 將剛羽化的成蟲按雌雄比例1 ∶1 配對飼養，逐日解剖成蟲。先用70%的酒精浸泡樣品10 min，之后在滴有Ring’s 生理鹽水的點滴盤中進行解剖，剔除生殖系統周圍的組織，用生理鹽水沖洗干凈，最后將完整的生殖器置于體視鏡（Zeiss，Stereo Discovery V2.0）下觀察并拍照。

1.2.2 卵巢管石蠟切片 選取羽化5 d 左右的雌成蟲，解剖出卵巢，方法同1.2.1，分離出完整的卵巢管，經Bouin’s 固定液固定、70%酒精沖洗、梯度濃度酒精脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、脫蠟、H.E 和甲苯胺藍染色等系列過程，在光學顯微鏡觀察并拍照。石蠟切片厚度為3～4 μm。

2 結果與分析

2.1 雌性生殖系統

龜紋瓢蟲雌性內生殖系統位于第3～8 腹節，包括1 對卵巢、1 對側輸卵管、中輸卵管、生殖腔。每側卵巢由11～13 根卵巢管組成，所有卵巢管通過端部的端絲束縛在一起，端絲白色，形成懸帶，懸附于第3 腹板。2 個側輸卵管匯合于中輸卵管，中輸卵管開口于生殖腔。受精囊暗紅色，角質化，半月形，其周圍很少附著組織，近乎裸露。雌蟲羽化后的約前3 d，卵巢附著很多白色氣管，之后氣管逐漸減少，直至卵成熟，幾乎不見氣管。當臨近產卵，側輸卵管變短變寬，側輸卵管管壁變得很薄，組織疏松（圖1A）。

2.2 雄性生殖系統

龜紋瓢蟲雄性內生殖系統位于第2～8 腹節，包括1 對精巢、1 對雄性附腺、1 對輸精管、貯精囊、射精管。每側精巢由10 個橢圓形的精巢管一端向內匯聚而成。輸精管和附腺比較短。射精管較長，半透明狀，與彎管相連（圖1 B）。

圖1 龜紋瓢蟲生殖系統Fig.1 Reproductive system of Propylea japonica

2.3 龜紋瓢蟲卵巢管結構

龜紋瓢蟲卵巢管屬于端滋式卵巢管，分為原卵區（germarium）、生長區（vitellatium）和端絲（terminal filament）。卵巢管外圍包被1 層管壁膜，由2 層薄膜構成。當卵細胞成熟且落入側輸卵管后，管壁膜清晰可見。原卵區分布著卵母細胞和滋養細胞，卵母細胞比較分散。原卵區與卵黃區的銜接處稱為卵巢管頸區，原卵區的卵細胞集中于此。卵黃區包含卵細胞，前濾泡細胞和濾泡細胞，卵細胞外層由濾泡細胞組成的細胞層覆蓋，這種結構稱為卵泡。龜紋瓢蟲卵巢管卵黃區可見4 個卵細胞（圖2A、B）。

2.4 龜紋瓢蟲卵子發生

龜紋瓢蟲的蛹期就已經形成了卵巢，并且已經完成生殖細胞的增殖與分化，形成由滋養細胞和卵母細胞組成的生殖細胞簇，但此時滋養細胞與卵母細胞形態相似，難以區分。

在卵細胞發生前期，滋養細胞和卵母細胞集中在原卵區且靠近端部，滋養細胞較集中，細胞核較大，染色深，幾乎充滿整個細胞。自然狀態下，滋養細胞呈現白色，通過切片染色細胞間偶見間質細胞，并出現雙核現象（圖2B、C），細胞核活動增強，出現染色質配對分離，這可能是為卵細胞輸送RNA 和其他營養物質的需要（圖2B）。卵母細胞分散在原卵區下端，個體比滋養細胞小，細胞核明顯可見（圖2C）。

圖2 龜紋瓢蟲卵巢管原卵區縱切Fig.2 Longitudinal section of germarium of Propylea japonica ovariole

卵細胞發生中期，卵細胞逐漸向卵黃區移動，細胞核明顯，染色較深，形成濾泡細胞和卵細胞組成的卵泡（follicle，圖3B）。卵細胞繼續增大，橢圓形，細胞質增多，細胞核出現胚泡，且胚泡染色明顯比細胞質淺，細胞核處在胚泡中央（圖3A）。

卵細胞發生的后期，卵細胞和胚泡繼續增大，卵細胞為橢圓形，而其周圍的濾泡細胞卻為圓形，此時期濾泡細胞核染色較深（圖3B）。

卵細胞發生的末期，卵細胞橢圓形，可見密集的卵黃顆粒和散布其中的脂滴。卵細胞周邊附著圓形濾泡細胞，且逐漸與濾泡細胞層分離，出現間隙，間隙首先出現在卵細胞之間的銜接處和卵巢管柄上方，隨之生成卵黃膜，并逐漸與卵巢管柄分離（圖3C、D）。

圖3 龜紋瓢蟲卵巢管生長區縱切Fig.3 Longitudinal section of vitellarium of Propylea japonica ovariole

3 討論

異色瓢蟲每側卵巢管數量25～33 根［19］，單雌平均產卵量1 835 粒［27］；七星瓢蟲每側卵巢管數量48 根，單雌產卵量400～900 粒，最多可達 2 000 多粒［21］；小黑瓢蟲每側卵巢管數量4 根［20］，單雌平均產卵量378.5 粒［28］。本研究觀察到龜紋瓢蟲每側卵巢管數量11～13 根，單雌平均產卵量600 粒，最多可達1 100 粒［1］。推測瓢蟲卵巢管數量與產卵量呈正相關。

試驗觀察到龜紋瓢蟲的卵巢管端滋式，且滋養細胞分散，細胞核幾乎充滿整個細胞，細胞膜清晰，未發現細胞分裂，與藻食亞目的Hydroscapha natansLeConte［15］不同的是，卵巢管未見合胞體（syncytium）。Buning［29］將鞘翅目多食性亞目昆蟲卵巢管分為3 個類型，分別為初級階段：滋養細胞分散，細胞膜界面清晰，細胞核容易辨別，細胞間僅通過胞間連絲相連；過渡階段：滋養細胞積聚形成細胞簇，細胞核非線性排列；次級階段：原卵區出現合胞體。據此推測龜紋瓢蟲卵巢管屬于原始類型。

研究發現，濾泡細胞是黑腹果蠅卵黃原蛋白主要合成位點［30］，也能協調卵黃原蛋白從血淋巴輸入細胞內［31］，其細胞間的橋粒（desmosomes）和微管塑造及維持卵的形態［32］。在對Tenebrio molitorL.研究發現，部分蛋白可通過濾泡細胞間隙進入卵細胞［33］。龜紋瓢蟲濾泡細胞的形態和數量在卵細胞發育過程中變化較大，卵子發生前期和中期，濾泡細胞呈橢圓形并且排列緊密，此時由滋養細胞和濾泡細胞共同為卵細胞提供營養物質；卵子發生后、末期，隨著卵細胞增大及卵黃的積累，濾泡細胞呈圓形且體積增大，細胞間隙較大，細胞核染色很淺，靠近濾泡細胞層處，卵黃顆粒較小，向內卵黃顆粒增大，推測濾泡細胞之間的間隙為卵細胞物質運輸的通道。

通過對果蠅和蝎蛉卵巢管研究發現，濾泡細胞參與卵殼的形成［34-35］。在Rhyncophorus palmarumLinnaeus 中也發現，當卵細胞成熟后，濾泡細胞層消失［36］。Loof［37］研究了馬鈴薯甲蟲（Leptinotarsa decemlineataSay）的濾泡細胞參與卵黃膜和卵殼形成的過程。卵黃沉積完成時，卵細胞與卵巢管柄逐漸分離，濾泡細胞與卵細胞出現間隙，靠近卵巢管柄處，濾泡細胞減少直至消失，可能與卵殼形成有關。

4 結論

龜紋瓢蟲單側卵巢管維持在11～13 根之間，每根卵巢管存在多個不同發育階段的卵細胞，且每次只能成熟并產出1 粒卵，這有助于解釋龜紋瓢蟲多次產卵的現象，也一定程度決定了單雌一生產卵數量。卵細胞發育過程中，養分供給來自多次形態變化的濾泡細胞。綜上所述，在開發人工飼料、開展龜紋瓢蟲大量繁育工作中，應合理配置飼料成分，確保卵巢養分需求，促進卵細胞發育成熟。